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Neuroscience

अभिवाही Dendrites cochlear इनर बालों की कोशिकाओं के संपर्क में postsynaptic रिकॉर्डिंग: एक रिबन Synapse पर निगरानी Multivesicular रिलीज

doi: 10.3791/2442 Published: February 10, 2011
* These authors contributed equally

Summary

भीतर स्तनधारी कोक्लीअ में बाल सेल रिबन synapse में श्रवण तंत्रिका फाइबर dendrites से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग.

Abstract

अभिवाही synapse भीतर बाल सेल (आईएचसी) और श्रवण तंत्रिका फाइबर के बीच एक एकल रिबन 1-4 synapse के postsynaptic गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए एक electrophysiologically सुलभ साइट प्रदान करता है. संवेदी कोशिकाओं के रिबन synapses neurotransmitter लगातार रिहाई दर जो आईएचसी झिल्ली 5 संभावित में वर्गीकृत परिवर्तन के जवाब में modulated है. रिबन synapses multivesicular विज्ञप्ति जारी की, जहां एक साथ कई vesicles जारी किया जा सकता है amplitudes 1, 4, 6-11 बदलती के उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSCs) पैदा द्वारा संचालित दिखाया गया है. न तो वर्तमान में presynaptic रिबन, और न ही multivesicular रिलीज अंतर्निहित तंत्र की भूमिका अच्छी तरह से समझ में आ रहा है.

आईएचसी 10-20 श्रवण तंत्रिका फाइबर, और unmyelinated एक एकल रिबन synapse फार्म समाप्त एकल के साथ हर फाइबर आईएचसी संपर्कों द्वारा innervated है. अभिवाही BOUTONS संपर्क IHCs (व्यास में लगभग 1 सुक्ष्ममापी) के छोटे आकार असाधारण अस्थायी समाधान के साथ रिकॉर्डिंग करने के लिए सक्षम बनाता है बनाया जा. इसके अलावा, इस तकनीक दोनों पूर्व और postsynaptic कोशिकाओं से एक साथ, synapse में हस्तांतरण समारोह 2 सीधे अध्ययन करने के लिए रिकॉर्ड की अनुमति अनुकूलित किया जा सकता है. इसलिए इस पद्धति का एक साधन है जिसके द्वारा neurotransmission के मौलिक पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है प्रदान करता है multivesicular रिलीज से संवेदी कोशिकाओं में रिबन की मायावी समारोह.

Protocol

1. समाधान

  1. समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है. कोशिकी समाधान 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है एक महीने के लिए. आंतरिक समाधान के Aliquots संग्रहीत किया जा जमी कर सकते हैं (-20 डिग्री सेल्सियस). सुनिश्चित करें कि समाधान प्रयोगों के शुरू होने से पहले कमरे के तापमान पर हैं.
  2. विदारक समाधान और कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी): KCl 5.8, 144 NaCl, 0.9 MgCl 2, 1.3 2 CaCl, 0.7 नाह 2 पीओ 4, 5.6 ग्लूकोज, 10 HEPES, एक ना पाइरूवेट, 7.4 पीएच (NaOH), 300 mOsm. आईएचसी Ca के लिए 2 + वर्तमान अलगाव कोशिकी समाधान संकेत के रूप में संशोधित किया जा सकता है: KCl 5.8, 114 NaCl, 0.9 MgCl 2, 1.3 2 CaCl, 0.7 नाह 2 पीओ 4, 5.6 ग्लूकोज, 10 HEPES, 30 चाय सीएल, 7.4 पीएच (NaOH ), 300 mOsm.
  3. 1-2 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin (TTX) कोशिकी वोल्टेज gated सोडियम चैनल ब्लॉक और उत्तेजक postsynaptic धाराओं या क्षमता (EPSCs या EPSPs) को अलग समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है.
  4. Intracellular रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी): 20 KCl, 110 कश्मीर methanesulfonate, 5 2 MgCl, 0.1 2 CaCl, EGTA 5, 5 HEPES, 5 ना एटीपी 2, 0.3 ना GTP 2, 5 ना 2 phoshocreatine, 7.2 पीएच (KOH), mOsm 290, या 135 KCl, 3.5 2 MgCl, 0.1 2 CaCl, EGTA 5, 5 HEPES, 4 ना एटीपी दो, ना 0.2 GTP 2, 7.2 पीएच (KOH), 290 mOsm. Intracellular समाधान आईएचसी Ca 2 के लिए + वर्तमान अलगाव: CsMeSO3 135, 13 चाय सीएल, 3.5 MgCl दो, ना 2.5 एटीपी 2, 1 EGTA, 7.2 पीएच (CsOH), 290 mOsm . यह समाधान बहुत बड़ा + K conductances की एक महत्वपूर्ण राशि ब्लॉक, 2 Ca छोड़ने + वर्तमान शेष होगा.

2. Dissected ऊतक धारकों बनाना

  1. संशोधित coverslips रिकॉर्डिंग के दौरान जगह में तैयार पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया भी अग्रिम में तैयार किया जा सकता है.
  2. एक परिपत्र गिलास coverslip (8-12 एमएम) के किनारे की ओर Sylgard (डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) की एक बूंद लागू करें. Coverslip पर एक ठीक कीट पिन (FST 26002-10 कोई आइटम) की मोटी अंत प्लेस. कीट पिन कस संदंश के साथ कांच के खिलाफ और पकड़ो sylgard सेट करने के लिए एक गर्म कुंडल के पास पकड़.

3. इलेक्ट्रोड बनाना

  1. प्रत्येक प्रयोगात्मक दिन और एक airtight बॉक्स में दुकान पर ताजा इलेक्ट्रोड तैयार. प्रत्येक तैयारी के लिए दस से बीस इलेक्ट्रोड बनाना.
  2. इलेक्ट्रोड कांच का चयन करें, हम 1 मिमी borosilicate ग्लास capillaries (डब्ल्यूपीआई 1B100F 4, Sarasota, FL से) का उपयोग करें.
  3. एक बहु कदम खींचने पर एक कार्यक्रम के लिए लगभग 2-3 सुक्ष्ममापी (~ ऊपर वर्णित समाधान में MΩ 6) के एक टिप व्यास के साथ इलेक्ट्रोड खींचने डिजाइन. हम एक Sutter P-87 बहु कदम क्षैतिज खींचने या एक Narishige ऊर्ध्वाधर खींचने PC-10 का उपयोग करें.
  4. ध्यान कोट टांग के Sylgard साथ इलेक्ट्रोड के रूप में संभव के रूप में टिप के करीब है. यह विंदुक समाई और कम से कम रिकॉर्डिंग शोर घट जाती है.
  5. आग पॉलिश जैसे कि थोक मूल्य सूचकांक से उपलब्ध एक गर्म फिलामेंट के साथ एक microforge का उपयोग कर इलेक्ट्रोड. आग पॉलिश इलेक्ट्रोड लगभग 1 सुक्ष्ममापी (ऊपर वर्णित समाधान में MΩ 10-15) के एक बाहरी टिप व्यास होना चाहिए. विंदुक दीवार की मोटाई के बारे में 1 / 3 सुक्ष्ममापी है. व्यास के बाहर अभिवाही समझौता हो bouton के आकार के बारे में है.
  6. युगपत रिकॉर्डिंग को लागू करने के मामले में आईएचसी विंदुक एक ही तरीके (एक ही गिलास, एक ही खींच प्रोग्राम) में निर्माण किया जाना चाहिए, साथ भेदभाव है कि आग चमकाने ~ 3 सुक्ष्ममापी (6 - 8 MΩ) एक बड़ा टिप व्यास छोड़ देना चाहिए.

4. प्रयोग की स्थापना

  1. कोशिकी समाधान और परीक्षण दवाओं या ब्याज की विषाक्त पदार्थों से युक्त समाधान के साथ गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव प्रणाली से जुड़े कक्षों भरें.
  2. छिड़काव सेट ताकि स्नान मात्रा लगभग 2 एमएल है, लगातार 1.5 एमएल 1 मिनट के आदेश पर एक दर पर perfuse.
  3. यदि अलग अलग समाधान के लिए एक स्थानीय छिड़काव प्रणाली के साथ प्रयोग के दौरान लागू किया जा रहे हैं, समाधान के साथ जलाशयों को भरने. समाधान प्रणाली के माध्यम से चलाने के लिए और सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवाई बुलबुले हैं.

5. विच्छेदन और नमूना तैयार

  1. साथ फिल्म तीन सप्ताह पुरानी चूहों (Sprague Dawley, चार्ल्स नदी), जो कि पहले प्रसव के बाद के चरणों के तुलना में अधिक मुश्किल है के लिए Corti के अंग के विच्छेदन दिखाता है. अलग अलग उम्र के चूहों से रिकॉर्डिंग के लाभ और कमियां चर्चा में की समीक्षा कर रहे हैं.
  2. गहरा isoflurane साँस लेना द्वारा चूहे चतनाशून्य करना. जब वापसी सजगता अनुपस्थित रहे हैं और corneal सजगता गंभीर रूप से उदास कर रहे हैं, सिर काटना. इन प्रक्रियाओं जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
  3. थूथन और decapitated सिर से त्वचा निकालें. सिर द्विविभाजित और लौकिक हड्डियों का पर्दाफाश करने के लिए मस्तिष्क को हटा दें.
  4. दोनों लौकिक हड्डियों और जगह साफ विदारक मानक कोशिकी समाधान युक्त बर्तन में निकालें.
  5. हटानाहड्डी टेम्पोरल हड्डी इतनी के रूप में encapsulating कोक्लीअ बेनकाब करने के लिए. संदंश की एक जोड़ी के साथ आधार पर अस्थायी हड्डी सुरक्षित पकड़ो. गोल और अंडाकार खिड़कियों को पहचानें. कोक्लीअ ताकि अंडाकार खिड़की और कोक्लीअ चेहरा ऊपर की बढ़ती पक्ष और कोक्लीअ के आसपास अतिरिक्त हड्डी निकालने ओर मालूम.
  6. कोक्लीअ encapsulating संवेदी उपकला का पर्दाफाश, देखभाल लेने के लिए शिखर तार, जो प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की रक्षा हड्डी निकालें. ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग कोक्लीअ बंद हड्डी सीधे चिप क्षेत्र है कि हड्डी के बाकी की तुलना में अधिक पारदर्शी है के साथ शुरुआत. यहाँ हड्डी पतली और निकालना आसान है. शिखर कुंडल आसपास से हड्डी को हटाने जारी रखें.
  7. माइक्रो - विदारक कैंची का प्रयोग शिखर बारी नीचे modiolus के माध्यम से कटौती. फिर कोक्लीअ के निचले मुड़ता से शिखर बारी काट.
  8. सूक्ष्म विदारक कैंची का प्रयोग करें फिर, यदि आवश्यक हो, करने के लिए सुनिश्चित करें कि शिखर बारी पूरी तरह कटे है. ख्याल रखना शिखर कुंडल की रक्षा, वह है या नहीं खींच फैला चाहिए. कोक्लीअ के बाकी हिस्सों से शिखर बारी मनाना ठीक संदंश का प्रयोग करें.
  9. शिखर बारी दोनों पक्षों से हड्डी के बाकी निकालें.
  10. ध्यान हलकी लीक vascularis, ऊतक के चमकदार बाल सेल क्षेत्र (1 योजनाबद्ध) के बाहर स्थित पट्टी हटा दें. संवेदी बालों की कोशिकाओं, जो आसानी से हलकी लीक vascularis के साथ अलग हो सकता को हटाने से बचने सुनिश्चित करें.
  11. ठीक संदंश का प्रयोग करें tectorial झिल्ली, चमकदार, अर्द्ध पारदर्शी झिल्ली है कि संवेदी बालों की कोशिकाओं के ऊपर बैठता है अलग.
  12. अब अतिरिक्त ऊतक और हड्डी ट्रिम और संदंश के साथ तैयारी समतल. यह आवश्यक है, ताकि ऊतक एक पिन के तहत समान रूप से रखा जा सकता है.
  13. एक coverslip (पहले) तैयार करने के लिए संलग्न है, ख्याल रख रही पिन बालों की कोशिकाओं से दूर स्थिति पिन के तहत तैयार रखें.
  14. रिकॉर्डिंग कक्ष में coverslip हस्तांतरण संदंश का प्रयोग करें. कर्णावत ऊतक coverslip स्थानांतरित whilst कोशिकी समाधान की एक बूंद के साथ पूरी तरह से कवर किया जाता है सुनिश्चित करें. Coverslip चैम्बर की गिलास नीचे पर मजबूती से नीचे प्रेस करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह रिकॉर्डिंग के दौरान कदम नहीं करता है.
  15. कोशिकी समाधान के साथ तत्काल छिड़काव शुरू, बेहतर तैयारी के अस्तित्व को सुनिश्चित करने.

6. रिकॉर्डिंग

  1. खुर्दबीन 10x और 40x पानी विसर्जन डीआईसी उद्देश्यों का उपयोग eyepieces के माध्यम से तैयारी का पता लगाएँ. ओर मालूम तैयारी इतना है कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड IHCs आईएचसी की पार्श्व दीवार orthogonally दृष्टिकोण कर सकते हैं.
  2. यदि तैयारी खत्म कर्ल करवाने IHCs के बेसल क्षेत्र की दृश्यता सीमित है, एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए कांच coverslip के खिलाफ तैयारी के बाहरी छोर नीचे धक्का, देखभाल लेने के लिए खुद को IHCs दबाने से बचने.
  3. * यदि युवा चूहों इस स्तर पर, बालों की कोशिकाओं के ऊपर कोशिकाओं का समर्थन करने में मोटी परत का उपयोग एक सफाई (~ 10-20 सुक्ष्ममापी के एक टिप व्यास के साथ) विंदुक संवेदी कोशिकाओं 1, 12 तक पहुँच पाने के साथ हटाया जा सकता है है.
  4. मॉनिटर का उपयोग का आकलन है कि ऊतक स्वस्थ है. खुर्दबीन और NC70 Newvicon कैमरा के बीच एक 4X बृहत्तरकरण लेंस का प्रयोग आगे छवि और बड़ी परियोजनाओं मॉनिटर पर के बारे में 4800 सुक्ष्ममापी 2 के एक क्षेत्र है. बालों की कोशिकाओं बरकरार बाल बंडलों के साथ लम्बी होना चाहिए. जब ऊतक कमजोर होती जाती है, बालों की कोशिकाओं के फूल और अधिक पारदर्शी और दानेदार हो.
  5. IHCs के आधार पर चारों ओर अभिवाही BOUTONS स्थानीय बनाना. BOUTONS गोलाकार या ellipsoidal हैं, व्यास में लगभग 1 सुक्ष्ममापी और एक चमकदार उपस्थिति के साथ रंग में प्रकाश कर रहे हैं. BOUTONS के बहुमत के नाभिक का स्तर नीचे स्थानीयकृत हैं. जब ऊतक है अस्वस्थ BOUTONS लगभग 4 बार सामान्य आकार के फूल और पारदर्शी हो चमकदार बजाय.
  6. Intracellular समाधान के साथ एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें सकारात्मक दबाव लागू और इलेक्ट्रोड पैंतरेबाज़ी के लिए तैयारी micromanipulator उपयोग.
  7. इलेक्ट्रोड के साथ आईएचसी बेस के स्तर पर तैयार करने में एक चीरा बनाओ. कोशिकाओं और IHCs समर्थन, सकारात्मक दबाव का उपयोग IHCs के आधार पर एक का उपयोग क्षेत्र के लिए मार्ग बना पतली परत के बीच इलेक्ट्रोड पुश. यह कदम अभिवाही bouton तक पहुँचने और कोशिकाओं को कसकर अभिवाही अंत ensheath समर्थन से रिकॉर्डिंग नहीं करने के लिए "कुंजी" है.
  8. ध्यान इलेक्ट्रोड हटाने और हौसले से भरा इलेक्ट्रोड के साथ जगह है.
  9. सकारात्मक दबाव का उपयोग करने के लिए एक साफ इलेक्ट्रोड टिप, इलेक्ट्रोड पैंतरेबाज़ी पहुँच छेद के माध्यम से आईएचसी की झिल्ली को बनाए रखने. सकारात्मक दबाव के समर्थन IHCs आसपास के कोशिकाओं के आसपास चल में सहायता करनी चाहिए.
  10. अभिवाही bouton (के रूप में साथ फिल्म में दिखाया गया है की दिशा में सन्निकट समर्थन कोशिकाओं के आसपास इलेक्ट्रोड ले जाएँ एक वैकल्पिक दृष्टिकोण करने के लिए एक चलती द्वारा अभिवाही bouton दृष्टिकोण है.लंबे समय आईएचसी झिल्ली इलेक्ट्रोड की नोक तक bouton छू). सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड टिप अभिवाही bouton के सामने सीधे है (वहाँ अभी भी bouton और विंदुक पर सकारात्मक दबाव की वजह से इलेक्ट्रोड के बीच एक छोटा सा अंतर है). BOUTONS समर्थन कोशिकाओं और आईएचसी झिल्ली से अधिक विंदुक के आंदोलन करने के लिए प्रतिरोध की पेशकश, वे experimenter द्वारा किया जा सकता है "महसूस" है.
  11. के ऊपर और नीचे विंदुक ले जाएँ और यकीन है कि कि bouton चाल बनाने के लिए धक्का. यह इंगित करता है कि विंदुक टिप और bouton एक ही Z-विमान में हैं.
  12. अभिवाही bouton के खिलाफ दबाया इलेक्ट्रोड के साथ, एक साथ एक सकारात्मक दबाव जारी है और लागू करने के लिए चूषण GΩ मुहर फार्म. एक अभिवाही bouton पर GΩ मुहर का गठन एक बाल सेल पर है कि समान है. सील गठन तेजी से हो कर सकते हैं या धीरे - धीरे होने पर हो सकती है.
  13. झिल्ली टूटना करने के लिए चूषण का कोमल फटने और इलेक्ट्रोड के भीतर लागू पूरे सेल रिकॉर्डिंग विन्यास दर्ज करें.
  14. यदि समझौता सेल एक अभिवाही bouton है, छोटे capacitative यात्रियों परीक्षण वर्ग सील गठन के दौरान निगरानी की नब्ज पर दिखाई देते हैं (चित्रा 1 देखें). 1.8 pF (3 देखें 4) - हम अभिवाही के लिए 0.4 के समाप्त होने के समाई अनुमान है. यदि समझौता सेल एक आईएचसी है, यात्रियों का उपयोग प्रतिरोध के आधार पर 3-5 बार बड़े के आदेश पर किया जाएगा.
  15. पुष्टि करें कि सेल एक अभिवाही bouton है, hyperpolarizing और depolarizing वोल्टेज कदम के साथ एक प्रोटोकॉल चलाते हैं. अभिवाही फाइबर और IHCs (अक्सर गलती से समझौता जब एक अभिवाही bouton के लिए लक्ष्य) के लिए वर्तमान वोल्टेज संबंध (IVS) अलग - अलग प्रकार की कोशिकाओं के लिए विशेषता हैं और चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  16. झिल्ली संभावित मॉनिटर, एक अभिवाही फाइबर के लिए, यह -60 के लिए -65 एम वी के आसपास सामान्य है.
  17. हौसले से भरा इलेक्ट्रोड के साथ 13 - यदि सेल एक अभिवाही bouton नहीं है, इलेक्ट्रोड और दोहराने कदम 8 हटायें. प्रत्येक प्रयास के लिए एक नया इलेक्ट्रोड का उपयोग करें.
  18. मॉनिटर वोल्टेज कदम करने के लिए सुनिश्चित करें कि मुहर नहीं बंद हो रहा है लागू करने के द्वारा रिकॉर्डिंग भर में श्रृंखला प्रतिरोध. यदि श्रृंखला प्रतिरोध बढ़ता है, यह सहायक हो करने के लिए चूषण का कोमल दालों लागू या इलेक्ट्रोड कदम पीछे की ओर थोड़ा कर सकते हैं. सीरीज resistances 30 के आसपास आम तौर पर MΩ हैं. जब synaptic गतिविधि का विश्लेषण, हम श्रृंखला resistances 50 MΩ से बड़ा के साथ रिकॉर्डिंग त्यागें.
  19. अब आप synaptic गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं (देखें चित्र 3). या तो अभिवाही फाइबर सहज गतिविधि दर्शाती है, या बाल सेल ट्रांसमीटर रिहाई को सक्रिय depolarized की जरूरत है. एक उच्च पोटेशियम एकाग्रता (उदाहरण के लिए 40 मिमी) के साथ एक बाह्य समाधान लागू बाल सेल को बिगाड़ना और अक्सर सक्रिय या ट्रांसमीटर रिहाई की दर में वृद्धि करेंगे.
  20. IHCs और अभिवाही BOUTONS 2 युगपत रिकॉर्डिंग के लिए, प्रक्रिया निम्नलिखित तरीके से संशोधित किया जाना चाहिए: चरण 1 के माध्यम से 5 के लिए आगे बढ़ें. 2 Ca के लिए इसी intracellular समाधान + वर्तमान अलगाव के साथ एक आईएचसी विंदुक भरें और पालन के रूप में 6 में संकेत दिया. आईएचसी रिकॉर्डिंग के लिए "इंतज़ार कर रही स्थिति" आईएचसी के लिए करीब से दर्ज किया जा विंदुक छोड़ो. अभिवाही रिकॉर्डिंग के लिए 14 - 6 चरणों के साथ जारी रखें. जब अभिवाही विंदुक पूरे सेल विन्यास में आईएचसी विंदुक के साथ जारी रखने के. तिकड़म इसी आईएचसी के पार्श्व दीवार की ओर दूसरा पिपेट, हमेशा सकारात्मक दबाव बनाए रखने. आईएचसी दबाव के माध्यम से पार्श्व दीवार पर एक खरोज दिखाने के लिए और यह सुनिश्चित हो कि समर्थन कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं की जरूरत है चाहिए. आईएचसी के लिए 12 कदम - 13 के रूप में अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है. के रूप में 14 में संकेत अभिवाही फाइबर की तुलना में, बड़ा capacitive यात्रियों आईएचसी रिकॉर्डिंग की एक बानगी विशेषता चतुर्थ संबंध के अलावा, कर रहे हैं. एक बार एक साथ रिकॉर्डिंग स्थापित कर रहे हैं, कुछ समय (3 - 5 मिनट, श्रृंखला प्रतिरोध पर निर्भर करता है) की अनुमति चाहिए और समाधान के लिए intracellular आईएचसी में धो. यह बड़ा 2 Ca + बहुत बड़ा + K conductances की बढ़ती ब्लॉक के कारण धाराओं में परिणाम देगा.
  21. आदेश में प्रदर्शन करने के लिए बाह्य रिकॉर्डिंग ढीले सील, 12 कदम पर एक GΩ मुहर बनाने के बजाय, अभिवाही bouton पर MΩ बारे में 30 से 50 के एक ढीला मुहर बना. यह सकारात्मक दबाव जारी whilst कम चूषण लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. 5 चित्रा एक p21 चूहे अभिवाही bouton से एक बाह्य रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण के लिए देखें.

7. मुसीबत शूटिंग

  1. यदि जवानों का गठन किया जा सकता है, लेकिन सेल संलग्न से पूरे सेल रिकॉर्डिंग करने के लिए संक्रमण को हासिल नहीं किया जा सकता, पिपेट की भीतरी व्यास भी संकीर्ण हो सकता है.
  2. यदि तंग जवानों का गठन नहीं किया जा सकता है, भीतर विंदुक व्यास बहुत बड़ा है और पूरी bouton इलेक्ट्रोड में शोषित हो सकता है हो सकता है.
  3. यदि सब कुछ synaptic घटनाओं छोटे और एक समान हैं, रिकॉर्डिंग अभिवाही करने के लिए बाह्य हो सकता है. सकारात्मक झिल्ली क्षमता पर घटनाओं के उत्क्रमण के लिए टेस्ट, intracellularly दर्जEPSCs सकारात्मक क्षमता को रिवर्स जाएगा.
  4. यदि श्रृंखला resistances लगातार उच्च रहे हैं जब पट्टी अभिवाही टर्मिनलों, विंदुक के पूरे सेल विन्यास में के माध्यम से तोड़ने के लिए प्रयास करने से पहले पीछे की ओर जाने की कोशिश. यह विंदुक clogging और उच्च का उपयोग प्रतिरोध को रोकने में मदद करता है.
  5. विंदुक की सही स्थिति निडर होकर. यह संभव है करने के लिए इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करने के लिए "खोने" अभिवाही पर मुहर के बिना उच्च श्रृंखला प्रतिरोध या विंदुक clogging कम. युगपत रिकॉर्डिंग स्थापना के दौरान, आईएचसी आमतौर पर 'धक्का दिया' bouton की ओर. अभिवाही विंदुक स्थिति के हिसाब से सही किया जा सकता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. अटल बिहारी. ठेठ यात्रियों को एक 10 एम वी -94 एम वी के एक होल्डिंग वोल्टेज से वोल्टेज आदेश hyperpolarizing के जवाब में एक अभिवाही (ए) फाइबर और आईएचसी (बी) से दर्ज की गई. संकीर्ण विंदुक व्यास और उच्च का उपयोग प्रतिरोध, आईएचसी रिकॉर्डिंग के कारण (बी) पूरे सेल आईएचसी रिकॉर्डिंग के लिए suboptimal है. रिकॉर्डिंग यहाँ दिखाया गया है केवल IHCs और अभिवाही फाइबर से capacitative यात्रियों के बीच अंतर का वर्णन करने के लिए. यह सेल प्रकार के बीच भेद जब पूरे सेल विन्यास बनाने में मदद कर सकते हैं. IHCs से पूरे सेल capacitative यात्रियों अभिवाही फाइबर से उन लोगों की तुलना में 5 गुना आयाम में बड़ा आदेश पर सीडी.. एक सूचना और प्रसारण से यात्रियों को एक विस्तारित timescale पर दिखाया गया है. सी. अभिवाही प्रतिक्रिया के क्षय दो exponentials के साथ फिट किया जा सकता है है. अभिवाही समाप्त होने की समाई तेजी घटक से अनुमान लगाया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. चतुर्थ एक अभिवाही bouton (ए) और एक आईएचसी (बी) से संबंधों. चतुर्थ संबंध -84 एम वी -124 एम वी से + 10 mV वेतन वृद्धि (नाममात्र voltages) में 36 एम वी वोल्टेज कदम के साथ एक होल्डिंग क्षमता से दर्ज कर रहे हैं. Voltages कुछ निशान के सही करने के लिए दिखाए जाते हैं. इन रिकॉर्डिंग बाहर कमरे के तापमान पर 5.8 मिमी कोशिकी KCl के साथ किए गए. दोनों के लिए स्केल: 500 PA, 200 एमएस.
प्रसव के बाद 19 दिन में एक अभिवाही फाइबर से एक. चतुर्थ संबंधों. EPSCs वोल्टेज कदम के बहुमत के दौरान मौजूद हैं, EPSCs 6 एम वी के लिए सकारात्मक रिवर्स. इस रिकॉर्डिंग बाहर TTX की उपस्थिति वोल्टेज gated ना + धाराओं ब्लॉक में किया गया. धीरे - धीरे सक्रिय hyperpolarizing voltages (मैं ज) में आवक वर्तमान ध्यान दें. यह वर्तमान IHCs या समर्थन कोशिकाओं में मौजूद नहीं है एक अच्छा संकेत है कि सेल से दर्ज एक अभिवाही फाइबर (3 देखें) बी. प्रदान करता है है. चतुर्थ P19 आईएचसी से संबंधों. संकीर्ण विंदुक व्यास और उच्च का उपयोग प्रतिरोध के कारण, रिकॉर्डिंग आईएचसी धाराओं और धाराओं छोटे से उम्मीद कर रहे हैं के लिए निस्र्पक suboptimal है. रिकॉर्डिंग यहाँ दिखाया गया है केवल चतुर्थ IHCs और अभिवाही फाइबर के संबंधों को प्रदर्शित करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जब एक अभिवाही फाइबर रिकॉर्डिंग प्रयास किया गया है. तेजी से सक्रिय सकारात्मक क्षमता (तीर) द्वारा पीछा देरी हो रही सही करनेवाला + 13 धाराओं कश्मीर पर जावक + K धाराओं नोट.

चित्रा 3
चित्रा 3 कापी synaptic 40 मिमी कोशिकी कश्मीर आईएचसी से रिहाई की दर में वृद्धि + की उपस्थिति में प्रसव के बाद 21 दिन में अभिवाही फाइबर से दर्ज धाराओं . TTX के साथ कमरा तापमान, वोल्टेज gated ना + धाराओं ब्लॉक लागू.. स्केल 200 फिलीस्तीनी अथॉरिटी, 5 ms, चर और EPSCs के आकार और आकृति ध्यान दें. EPSC विशेषताओं का एक विस्तृत वर्णन के लिए 4 बी देखते हैं.. दो EPSCs एक (multiphasic, ओ # monophasic) में चिह्नित एक विस्तारित पैमाने पर दिखाया: स्केल 100 फोनों के लिए, 1 एमएस.

चित्रा 4
चित्रा 4 एक आईएचसी के युगपत रिकॉर्डिंग और excised Corti, प्रसव के बाद 10 दिन (भी 2 देख) के चूहे अंग में अभिवाही bouton से संपर्क . एक वोल्टेज आईएचसी depolarizing कदम neurotransmitter की रिहाई भड़काती है और अभिवाही bouton में EPSCs सक्रिय ऊपरी ट्रेस: ​​आईएचसी विध्रुवण के लिए वोल्ट प्रोटोकॉल . होल्डिंग क्षमता: एम वी -79, 50 एमएस -29 एम वी के लिए कदम मध्य ट्रेस: ​​एल प्रकार 2 Ca + आईएचसी से दर्ज धाराओं आमतौर पर थोड़ा निष्क्रियता दिखाने और नकारात्मक क्षमता पर सक्रिय नीचे ट्रेस: ​​जवाब में अभिवाही फाइबर में Synaptic धाराओं आईएचसी विध्रुवण. एक 50 एमएस आईएचसी विध्रुवण के दौरान synaptic अवसाद नोट.

चित्रा 5
चित्रा 5. एक कापी प्रसव के बाद 21 दिन में एक अभिवाही bouton से कोशिकी रिकॉर्डिंग. यह कमरा तापमान में दर्ज किया गया था5.8 मिमी कोशिकी + K के साथ ऊपरी . इस रिकॉर्डिंग तैयार करने में एक रिकॉर्डिंग के लिए शोर अनुपात करने के लिए एक तीन सप्ताह पुराने चूहे से एक विशिष्ट संकेत बी है.. कोशिकी एक P20 अभिवाही bouton से दर्ज की घटनाओं के लिए औसत तरंग. यह 10272 की घटनाओं से औसत तरंग है.

एक योजनाबद्ध
योजनाबद्ध 1. एक चूहे आंतरिक और बाहरी बालों की कोशिकाओं, सर्पिल ganglia, हलकी लीक vascularis और tectorial झिल्ली के बीच शारीरिक संबंध illustrating कोक्लीअ के एक मोड़ के माध्यम से अनुभागीय दृश्य क्रॉस.

Discussion

इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम विच्छेदन है. यदि ऊतक या फैला विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त, अभिवाही फाइबर जीवित नहीं होगी. युवा चूहों से ऊतक अधिक लोचदार और क्षमा है. हम पाते हैं कि प्रसव के बाद दिन 10 से 11 के लिए काटना आसान कर रहे हैं और प्रयोगों उच्च सफलता दर है. कर्णावत परिपक्वता का एक महत्वपूर्ण डिग्री postnatally के लिए प्रसव के बाद दिन भर से 14 12 सुना शुरुआत चूहों के साथ होता है . इसलिए, उम्र में जहां विच्छेदन आसान है, synapses पूरी तरह परिपक्व नहीं हो 4 हो सकता है.

चूहों के लिए यहाँ वर्णित विच्छेदन अनिवार्य रूप से चूहों, माउस कोक्लीअ के छोटे आकार के किया जा रहा है मुख्य अंतर के लिए एक ही है. इस तकनीक रिबन synapses के गुण transgenically संशोधित 15 चूहों में जांच करने के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक के लिए इसके अलावा संशोधनों में शामिल हैं: लेबल 3 तंतुओं को intracellular समाधान के लिए एक फ्लोरोसेंट रंजक जोड़ने, presynaptic भीतर बाल सेल और postsynaptic अभिवाही bouton के साथ बनती रिकॉर्डिंग, की अनुमति पहले और बाद synaptic कोशिकाओं के बीच हस्तांतरण समारोह 2 निर्धारित किया और ढीली अभिवाही BOUTONS पर कोशिकी रिकॉर्डिंग मुहर सेलुलर अखंडता के नुकसान से बचने के लिए. कोशिकी रिकॉर्डिंग विन्यास पूरे सेल विन्यास की तुलना में आसान पाने के लिए है और प्रयोगों आम तौर पर कर रहे हैं लंबे समय तक टिकाऊ है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम EY बहरापन रिसर्च फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और DC006476 NIDCD DC005211 NIDCD द्वारा सुनवाई और शेष के लिए केंद्र, जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के लिए ईजी और. कलाकृति कॉपीराइट टिम फेल्प्स, जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय.

एलजी प्रारंभिक पांडुलिपि लिखा था, EY और एलजी विच्छेदन और रिकॉर्डिंग फिल्माया. सभी लेखकों कापी आंकड़े प्रदान और पांडुलिपि लिखने के लिए योगदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air table TMC
Gibraltar Stage with xy-table Burleigh
Axioscope FS2 upright microscope DIC optics Green filter Carl Zeiss, Inc.
Newvicon camera with controller Dage
Monitor Dage
Multiclamp 700B (or similar) Molecular Devices
Digidata 1322A (or similar) Molecular Devices
Manipulator MP285 Sutter Instrument Co.
6-channel valve application system for local perfusion (used with hand made perfusion pipettes) Warner Instruments
PC with acquisition software (PClamp) Molecular Devices
Above is the equipment in our electrophysiological setups used for recording from afferent terminals.

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References

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अभिवाही Dendrites cochlear इनर बालों की कोशिकाओं के संपर्क में postsynaptic रिकॉर्डिंग: एक रिबन Synapse पर निगरानी Multivesicular रिलीज
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Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J. Vis. Exp. (48), e2442, doi:10.3791/2442 (2011).More

Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J. Vis. Exp. (48), e2442, doi:10.3791/2442 (2011).

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