Summary
Dit protocol beschrijft een activiteit-gebaseerde test voor het opsporen van matrix metalloproteïnasen in kweeksupernatanten of lichaamsvloeistoffen.
Abstract
Matrix (MMP's) zijn zink-bevattende endopeptidasen. Ze breken eiwitten door splitsing van peptidebindingen. Meer dan twintig MMP's zijn geïdentificeerd en worden gescheiden in zes groepen op basis van hun structuur en substraat specificiteit (collagenases, gelatinasen, membraan [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, en anderen). MMP's spelen een cruciale rol in cel invasie, afbraak van kraakbeen, weefsel remodelleren, wondgenezing, en embryogenese. Daartoe nemen zij deel in zowel de normale processen en in de pathogenese van vele ziekten, zoals reumatoïde artritis, kanker, of chronische obstructieve longziekte 1-6. Hier zullen we ons richten op MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), een breed uitgedrukt MMP. We zullen laten zien hoe u MMP-2 te detecteren in cel kweeksupernatanten door zymografie, een veel gebruikte, eenvoudige en toch zeer gevoelige techniek voor het eerst beschreven in 1980 door C. Heussen en EB Dowdle 7-10. Deze techniek is semi-kwantitatief, kan dus gebruikt worden om MMP niveaus in proefmonsters bepalen wanneer bekende concentraties van recombinant MMP worden geladen op dezelfde gel 11.
Oplossingen die MMPs (bijv. mobiele kweeksupernatanten, urine of serum) worden geladen op een polyacrylamide gel met natriumdodecylsulfaat (SDS, om de eiwitten lineariseren) en gelatine (substraat voor MMP-2). Het monster buffer is bedoeld om te proeven viscositeit te verhogen (tot gel laden te vergemakkelijken), een tracking kleurstof (broomfenolblauw, om te proeven migratie monitor) te bieden, om te voorzien denatureren moleculen (aan eiwitten lineariseren), en de controle van de pH van het monster. Eiwitten worden dan toegestaan om op grond van een elektrische stroom migreren in een actieve buffer ontworpen om een constante migratie tarief te bieden. De afstand van de migratie is omgekeerd gecorreleerd met het molecuulgewicht van het eiwit (kleine eiwitten bewegen sneller door de gel dan de grote eiwitten doen en daarom verder naar beneden de gel migreren). Na de migratie, wordt de gel in een renaturing buffer om eiwitten om hun tertiaire structuur, die noodzakelijk zijn voor enzymatische activiteit te herwinnen. De gel wordt dan geplaatst in een ontwikkelingsland buffer is ontworpen om de protease aan de ondergrond te verteren. De ontwikkelingslanden buffer bevat ook p-aminophenylmercuric acetaat (APMA) om de niet-proteolytische pro-MMP's te activeren in actieve MMPs. De volgende stap bestaat uit het kleuren van de ondergrond (gelatine in ons voorbeeld). Na het wassen de overtollige kleurstof uit de gel, de gebieden van protease spijsvertering verschijnen als duidelijk bands. Hoe duidelijker de band, hoe geconcentreerder de protease bevat. Band kleuringsintensiteit kan dan worden bepaald door densitometrie, met behulp van een software zoals ImageJ, waardoor sample vergelijking.
Protocol
1. Het laden en draaien van de Gel
- Alle monsters moeten adequaat worden voorbereid om de functie van de enzymen te behouden en direct gebruikt na inzameling of bevroren opgeslagen bij -80 ° C. De monsters mogen geen reductiemiddelen (zoals een β-mercapto-ethanol) of worden gekookt alvorens gel geladen.
- Open het zakje met een gel in een cassette, spoel de cassette met gedeïoniseerd water.
- Verwijder de beschermende tape van de onderzijde van de cassette en de kam van de bovenkant van de gel.
- Spoel de putjes drie keer met stromend buffer (verdund tot 1X in gedemineraliseerd water).
- Plaats de gel in de Mini-Cell, zodat de kleinere kant van de cassette naar binnen gezichten. Vastklikken met de Gel Tension Wedge. De Mini-Cell maakt het mogelijk om een of twee gels parallel lopen.
- Vul de top (binnen) kamer met 1X loopbuffer boven putten niveau, controleren op eventuele lekkages. In het geval van lekken, verwijder de buffer en de positie van de gel.
- Vul de Tweede Kamer met 1X lopen buffer.
- Belasting 10 pi van eiwitten moleculaire merker in een goed.
- Meng een gelijke hoeveelheid van de gel-loading buffer en van het monster en laden in de putjes van de gel met behulp van gel-loading tips (veranderd tussen elk monster). Deze putten kunnen worden geladen met maximaal 20 pi totaal.
- Plaats het deksel op de Mini-Cell en sluit de elektrode snoeren op de voeding. Schakel de voeding op en zet deze om te draaien met 125 V constant gedurende 90 minuten. Controleer de vorming van kleine belletjes op de draad van de Tweede Kamer, met vermelding van de huidige circulatie.
- Bij het uitvoeren van uw eerste gel, de voortgang van de migratie om de 15 minuten, met behulp van de broomfenolblauw opgenomen in de laadbuffer als een indicator. Laat de gel draaien totdat de indicator kleurstof bereikt de onderkant van de gel.
2. Renaturing en Ontwikkeling van de Gel
- Voor elke gel, bereiding van 100 ml 1X renaturing buffer en 200 ml van de denaturering buffer, zowel in gedeïoniseerd water.
- Wanneer de broomfenolblauw tracking kleurstof de bodem van de gel heeft bereikt, schakelt de stroomvoorziening uit, open de Mini-Cell, en verwijder de gel. Scheid de twee zijden van de cassette het gebruik van de gel mes (of een gewicht van spatel). Snij een hoek om de gel de richting markeren.
- Verwijder voorzichtig de gel uit de cassette en plaats in een container met 100 ml renaturing buffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Verwijder de renaturing buffer en voeg 100 ml van de ontwikkeling van buffer naar de gel. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Verwijder de zich ontwikkelende buffer en voeg 100 ml meer van de ontwikkeling van buffer naar de gel. Incubeer overnacht (16-18 uur) bij 37 ° C.
- Verwijder de zich ontwikkelende buffer en spoel drie keer (5 minuten) met gedemineraliseerd water onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Scan de gel om de exacte positionering van het eiwit standaard banden op te slaan als ze minder of niet zichtbaar zijn na gel kleuring.
- Vlekken op de gel door het toevoegen van 20 ml SimplyBlue Safestain aan de gel. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Verwijder de SimplyBlue SafeStain en de-vlek van de gel in 100 ml of meer gedeïoniseerd water gedurende een uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Voor betere resultaten, te vervangen met vers gedeïoniseerd water en incubeer gedurende een uur of meer bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
3. Data Analysis
- Verwijder voorzichtig de gel uit het water en in een plastic beschermer.
- Scan de gel met een resolutie van 300 dpi of hoger. Sla de afbeelding op in het TIFF-formaat (Figuur 1A).
- Meet band intensiteiten ImageJ (of een andere soortgelijke software).
- Open het TIFF-bestand in ImageJ (Figuur 1A).
- Visualiseer in zwart en wit door het selecteren van "Image> type> 8-bit" (Figuur 1B).
- Gebruik de rechthoekige selectie gereedschap om de eerste band overzicht, het tekenen van een rechthoek ten minste twee keer hoger is dan breed is (dit is een software-eis).
- Druk op "1" of "Analyze> Gels> Selecteer eerst lane" en de band zal worden geschetst.
- Een nieuwe rechthoek zal verschijnen, verplaatsen naar de volgende band en selecteer "Analyze> Gels> Selecteer volgende baan". Herhaal dit totdat alle bands zijn geselecteerd (Figuur 1B).
- Druk op "3" of "Analyze> Gels> Plot rijstroken" om het profiel plot voor elke band (figuur 1C) te genereren.
- Gebruik de rechte lijn selectie (moet al automatisch worden geselecteerd) te baseren lijnen te trekken, zodat het hoogtepunt van belang is een volledig afgesloten ruimte.
- Selecteer het gereedschap toverstaf en klik in elke piek om deze te selecteren.
- Selecteer "Analyze> Gels> Label pieken" om een tafel te krijgen met het gebied voor elke geselecteerde piek. Deze gegevens kunnen worden uitgezet als zodanig (Figure 1D) of kan worden genormaliseerd om de waarde van een gekozen band. Deze normalisering is vooral belangrijk als bundeling van waarden uit verschillende repliceren gels om statistische significantie van de resultaten bepalen.
4. Representatieve resultaten
We tonen een gel met 11 putten geladen met andere cel kweeksupernatanten met verschillende hoeveelheden van MMP-2 (Figuur 1A). Directe waarneming van deze gel laat duidelijke verschillen in MMP-2 concentraties van een aantal van de putten. Bijvoorbeeld, is het duidelijk dat putten # 4 en 5 nog veel meer MMP-2 dan ook # 11 of zelfs goed # 10 bevatten. Voor de objectieve kwantificering van bands die we hebben gebruikt densitometrie met de ImageJ software (Figuur 1B-D), bevestigt een ongeveer 4-voudig verschil in MMP-2 bedragen tussen goed # 11 en # putten 4 en 5 en een ongeveer 2-voudig verschil in MMP-2 bedragen tussen goed # 10 en # putten 4 en 5.
Figuur 1. Detectie van MMP-2 door gelatine zymografie. A, gescande beeld van een gelatine gel. Nou nummers zijn aangegeven op de bovenkant van de gel. B, dezelfde gel als in A weergegeven in zwart-wit voor densitometrie. Elke band werd geselecteerd met een rechthoek in ImageJ. C, Twee voorbeelden van densitometrie profielen voor de gel die in A en B (bands # 4 en # 11). Een rechte lijn werd getrokken aan de basis van elke piek een gesloten ruimte te creëren. D, Standplaats van de piek gebieden voor de gel die in A en B voor (links) en na (rechts) normalisatie om de dichtheid van de band # 1.
Figuur 2. Dit cijfer laat zien hoe zymografie gebruikt kan worden als een semi-kwantitatieve techniek. We hebben geladen seriële verdunningen (stappen van 1:1 verdunningen) in 7 opeenvolgende putten en gemeten de band dichtheden voor zowel de pro-MMP-2 en MMP-2.
Discussion
We hebben aangetoond hoe zymographic analyse van MMP-2 in cel kweeksupernatanten uit te voeren.
De hoeveelheid van het monster te laden op een gel moet worden bepaald empirisch afhankelijk van de herkomst en de MMP van belang. Het laden te weinig zal voorkomen dat detectie tijdens het laden te veel kan leiden tot een verzadiging als er maar zo veel substraat een protease kan verteren in het gebied van de band. Indien nodig, kan het monster worden verdund in gedeïoniseerd water vóór het mengen met het laden van buffer of het ontwikkelen van de tijd kan de verlaagd van 's nachts tot 4 uur. Het is ook mogelijk om eiwitten te concentreren in een oplossing met behulp van concentrators (bijv. Millipore catalogus # UFC803024). Als bands blijven nauwelijks zichtbaar zijn, kan het nodig zijn om de gels voor een langere tijd ontwikkelen, zelfs tot 48 uur. Bij de voorbereiding van monsters van weefsel kweeksupernatanten, dient te worden opgemerkt dat foetale runder serum (en andere sera) MMP's die invloed hebben op de resultaten bevat. Om deze reden, verzamelen we al onze supematanten na cultuur in serum-vrij medium.
Het wast beschreven in de paragrafen 2.9 en 2.10 van het protocol nodig zijn om de achtergrond kleuring van verteerde banden te verwijderen. Langere wastijden verwijdert meer achtergrond, maar zal ook dimmen de kleuring van de ondergrond in de gel. Als er langere tijd was nodig zijn, raden we het scannen van de gel om de paar uur om de scan te selecteren met de beste contrast.
Deze techniek kan gebruikt worden om andere MMP's op te sporen. Kan bijvoorbeeld MMP-9 worden gedetecteerd op gelatine gels, en ook in mindere mate MMP-1, MMP-8 en MMP-13 zoals gelatine is niet hun voorkeur substraat. MMP-1 en MMP-13 zijn het beste gedetecteerd op collageen zymografie terwijl caseïne is de beste substraat voor MMP-11 en maakt het ook mogelijk voor de detectie van MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 en MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) en collagenasen (MMP-1 en MMP-13) zijn moeilijk te detecteren wanneer deze zich op een laag niveau in caseïne of gelatine gels. Toevoeging van heparine aan de steekproef op het moment van het laden van gel verbetert de detectiegrens voor MMP-7. Voor MMP-1 en MMP-13, de heparine te worden toegevoegd aan de gel na het elektroforetisch run is al aan de gang 12.
Sinds zymografie maatregelen enzymatische activiteit na denaturatie en renaturatie van de enzymen, zal het meten van de activiteit van alle MMP's in het monster aanwezig. Deze enzymen, pro-enzymen, en enzymen gebonden aan endogene remmers (bijv. TIMP-2). Het is echter mogelijk om het niveau van MMP activering in de monster te bepalen door het vergelijken van de band dichtheid van het actieve enzym en van die van de pro-enzym, dat een iets hoger moleculair gewicht zal hebben.
Zymografie is vaak niet voldoende om een MMP te identificeren. Vergelijking van de migratie van een MMP met een bekend molecuulgewicht normen helpt bij de identificatie, maar dient te worden opgemerkt dat sommige van deze normen een reductiemiddel bevat en dat bij gebruik onder niet-reducerende voorwaarden zij zich kunnen wijzen op verschillende moleculaire gewichten 9. Een optie is om een oplosbare recombinant MMP belasting op dezelfde gel als de analysemonsters. MMPs kunnen echter in verband worden gebracht met andere eiwitten, het induceren van een verandering in de schijnbaar moleculair gewicht. Selectieve MMP-remmers kan worden toegevoegd aan de gel (of een deel van een gel gehalveerd) tijdens de incubatie in de ontwikkeling van buffer als farmacologische instrumenten om de identiteit van de MMP van interest.A tweede techniek (Western Blot, immunocytochemie, of ELISA) wordt aanbevolen om helpen bij de identificatie van de MMP van belang. Opgemerkt moet worden dat de detectielimieten voor de westerse Blots vaak veel lager dan die van zymographic gels, wat kan leiden tot fout-negatieve resultaten bij het gebruik van deze techniek.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr S. Ressler (Departement Moleculaire en Cellulaire Biologie, Baylor College of Medicine) bedanken voor het suggereren van het gebruik van eiwit concentrators om de concentratie van MMP's te verhogen in cel kweeksupernatanten.
Dit project werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en de NIH / NIAMS (AR059838) naar CB. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
