Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine activity-based-Assay zum Nachweis Matrixmetalloproteinasen in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten.
Abstract
Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind Zink-haltigen Endopeptidasen. Sie bauen Proteine durch Spaltung von Peptidbindungen. Mehr als zwanzig MMPs wurden identifiziert und sind in sechs Gruppen auf ihre Struktur und Substratspezifität (Kollagenasen, Gelatinasen Membran Typ [MT-MMP], Stromelysine, matrilysins, und andere) basieren getrennt. MMPs spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Invasion Knorpelabbau, Gewebe-Remodeling, Wundheilung, und Embryogenese. Sie daher in normalen Prozessen und in der Pathogenese vieler Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Krebs oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung 1-6 teilnehmen. Hier werden wir uns auf MMP-2 (Gelatinase A, Typ IV Kollagenase), eine weit verbreitete Ausdruck MMP konzentrieren. Wir werden zeigen, wie MMP-2 in Zellkulturüberständen erkennen zymographisch, eine häufig verwendete, einfache und doch sehr sensible Technik zuerst 1980 von C. Heussen und EB Dowdle 7-10 beschrieben. Diese Technik ist semi-quantitative, kann es daher zur MMP Ebenen in Testproben zu bestimmen, wenn bekannte Konzentrationen von rekombinanten MMP auf dem gleichen Gel 11 sind geladen werden.
Und Gelatine (Substrat für MMP-2); Lösungen, die MMPs (zB Zellkulturüberstände, Urin oder Serum) werden auf ein Polyacrylamidgel mit Natriumdodecylsulfat (um die Proteine zu linearisieren SDS) geladen. Der Probenpuffer wurde entwickelt, um Proben Viskositätsanstieg (bis Gelbeladung zu erleichtern), eine Tracking-Farbstoff (Bromphenolblau; zum Beispiel die Migration-Monitor), bieten denaturierenden Moleküle (Proteine linearisieren) und Kontrolle der pH-Wert der Probe. Proteine sind dann unter einen elektrischen Strom in einem Laufpuffer entworfen, um eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit bieten zu migrieren. Der Abstand der Migration ist umgekehrt mit dem Molekulargewicht des Proteins (kleine Proteine schneller bewegen durch das Gel als große Proteine und damit die Migration weiter unten in der Gel) korreliert. Nach der Migration wird das Gel in einer Renaturierungspuffer gelegt, damit Proteine ihre Tertiärstruktur, die für enzymatische Aktivität wiederzugewinnen. Das Gel wird dann in einem Entwicklungsland Puffer so konzipiert, dass die Protease seine Substratverdau platziert. Die Entwicklung Puffer enthält auch p-aminophenylmercuric (APMA), um den nicht-proteolytische Pro-MMPs in den aktiven MMPs aktivieren. Der nächste Schritt besteht in der Färbung des Substrats (Gelatine in unserem Beispiel). Nach dem Waschen der überschüssigen Farbstoff aus dem Gel Bereichen Proteaseverdau als klare Streifen erscheinen. Je klarer die Band, je konzentrierter die Protease enthält. Band Färbeintensität kann dann durch Densitometrie ermittelt werden, mit einer Software wie ImageJ, so dass für die Probenvorbereitung Vergleich.
Protocol
1. Laden und Ausführen der Gel
- Alle Proben sind entsprechend vorbereitet werden, um die Funktion der Enzyme erhalten und sofort nach der Entnahme verwendet oder gelagert bei -80 ° C. Die Proben dürfen keine Reduktionsmittel (eine solche β-Mercaptoethanol) oder vor Gelbeladung abgekocht werden.
- Öffnen Sie den Beutel mit einem Gel in einer Kassette, spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser.
- Entfernen Sie die Schutzfolie von der Unterseite der Kassette und der Kamm von der Spitze des Gels.
- Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Laufpuffer (verdünnt auf 1X in VE-Wasser).
- Legen Sie das Gel in den Mini-Cell, sicherzustellen, dass die kleinere Seite der Kassette nach innen Gesichter. Einrasten mit dem Gel Tension Wedge. Die Mini-Cell erlaubt es, ein oder zwei Gele parallel laufen.
- Füllen Sie den oben (innen) Kammer mit 1X-Laufpuffer über Brunnen Ebene, auf Lecks überprüfen. Im Falle eines Lecks, entfernen Sie die Puffer und die Position des Gels.
- Füllen Sie die untere Kammer mit 1X-Laufpuffer.
- Legen Sie 10 ul Protein molekularer Marker in einem gut.
- Mix eine gleiche Menge an Gel-Ladepuffer und der Probe und der Last in die Vertiefungen des Gels mit Gel-loading Tipps (geänderte zwischen jeder Probe). Diese Vertiefungen können mit geladen werden bis zu 20 ul total.
- Setzen Sie den Deckel auf dem Mini-Cell und die Elektrode Kabel an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung an und stellen es auf 125 V konstant für 90 Minuten laufen. Überprüfen Sie die Bildung von kleinen Bläschen auf den Draht der unteren Kammer, zur Anzeige der aktuellen Auflage.
- Bei der Ausführung Ihrer ersten Gel, Monitor Fortschritt der Migration alle 15 Minuten, mit dem Bromphenolblau im Ladepuffer als Indikator enthalten. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Indikator-Farbstoff erreicht den Boden des Gels.
2. Renaturierung und Entwicklung der Gel
- Für jedes Gel, Herstellung von 100 ml 1X Renaturierungspuffer und 200 ml denaturierenden Puffer, sowohl in deionisiertem Wasser.
- Wenn die Bromphenolblau Markerfarbstoff der Unterseite des Gels erreicht hat, schalten Sie die Stromversorgung aus, öffnen Sie den Mini-Cell, und entfernen Sie das Gel. Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette mit der Gel-Messer (oder einer Waage Spatel). Schneiden Sie eine Ecke, um das Gel die Richtung zu markieren.
- Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus der Kassette und in einen Behälter mit 100 ml Renaturierungspuffer. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Entfernen Sie die Renaturierungspuffer und 100 mL der Entwicklung Puffer, um das Gel. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und 100 ml mehr entwickeln Puffer, um das Gel. Inkubieren über Nacht (16-18 Stunden) bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und spülen dreimal (5 Minuten) mit destilliertem Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
- Scannen Sie das Gel auf die exakte Positionierung des Proteins Standard Bands sparen werden, da sie weniger oder gar nicht sichtbar, nachdem Gelfärbung.
- Stain das Gel durch Zugabe von 20 ml SimplyBlue Safestain auf das Gel. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Entfernen Sie die SimplyBlue SafeStain und de-Fleck das Gel in 100 ml oder mehr VE-Wasser für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Für bessere Ergebnisse mit frischem deionisiertem Wasser und inkubieren ersetzen noch eine Stunde oder mehr bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
3. Data Analysis
- Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Wasser und in einer Plastikplane Schutz.
- Scannen Sie das Gel mit einer Auflösung von 300 dpi oder höher. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format (Abbildung 1A).
- Messen Bandenintensitäten mit ImageJ (oder eine andere ähnliche Software).
- Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ (Abbildung 1A).
- Visualisieren Sie in Schwarz und Weiß, indem Sie "Bild> Typ> 8-bit" (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie die rechteckige Auswahl Werkzeug, um die erste Band, skizzieren, zeichnen Sie ein Rechteck mindestens zweimal höher als breit ist (dies ist ein Software-Anforderung).
- Drücken Sie die "1" oder wählen Sie "> Gels Analyze> Wählen erste Gasse" und die Band skizziert werden soll.
- Ein neues Rechteck erscheint, verschieben Sie es auf die nächste Band, und wählen Sie "Analysieren> Gele> Wählen nächsten lane". Wiederholen, bis alle Bands ausgewählt werden (Abbildung 1B).
- "3" drücken, oder wählen Sie "Analysieren> Gele> Plot Gassen", um das Profil Grundstück für jedes Band (Abbildung 1C) zu generieren.
- Verwenden Sie die gerade Linie Auswahl (sollte bereits automatisch ausgewählt werden), um Grundlinien zu ziehen, so dass die Spitze von Interesse ist eine komplett geschlossene Fläche.
- Wählen Sie den Zauberstab-Werkzeug und klicken Sie in jeder Spitze um es auszuwählen.
- Wählen Sie "Analysieren> Gele> Label Spitzen", um eine Tabelle mit dem Bereich für jede ausgewählte Gipfel zu erreichen. Diese Daten können als solche dargestellt werden (FBBILDUNG 1D) oder auf den Wert einer ausgewählten Band normalisiert werden. Diese Normalisierung ist besonders wichtig, wenn die Bündelung Werte von mehreren replizieren Gele, um statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Wir zeigen ein Gel mit 11 Bohrungen mit unterschiedlichen Zellkulturüberständen mit unterschiedlichen Mengen an MMP-2 (Abbildung 1A) geladen. Die direkte Beobachtung dieses Gel zeigt deutliche Unterschiede in MMP-2-Konzentrationen zwischen einigen der Brunnen. Zum Beispiel ist es klar, dass Brunnen Nr. 4 und 5 viel MMP-2 als auch Nr. 11 oder sogar auch Nr. 10 enthalten. Für objektive Quantifizierung der Bands, die wir haben Densitometrie mit dem ImageJ-Software (Abbildung 1B-D) verwendet wird, bestätigt eine ca. 4-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 11 und # Brunnen 4 und 5 sowie einer ca. 2-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 10 und # Brunnen 4 und 5.
Abbildung 1. Erkennung von MMP-2 durch Gelatine Zymographie. A, gescannte Bild einer Gelatine-Gel. Nun Zahlen sind am oberen Rand des Gels angegeben. B, Same-Gel wie in A gezeigt in schwarz und weiß für Densitometrie. Jeder Band wurde mit einem Rechteck in ImageJ ausgewählt. C, Zwei Beispiele für Densitometrie-Profile für das Gel gezeigt in A und B (Bänder # 4 und # 11). Eine gerade Linie war an der Basis jeder Spitze gezogen, um einen geschlossenen Raum zu schaffen. D, Plot der Peakflächen für das Gel in A und B vor (links) und nach (rechts) Normalisierung der Dichte der Band Nr. 1 dargestellt.
Abbildung 2. Diese Zahl zeigt, wie Zymographie als semi-quantitative Verfahren eingesetzt werden kann. Wir haben serielle Verdünnungen (Schritte von 1:1 Verdünnungen) in 7 aufeinander folgenden Bohrungen geladen und gemessen die Band Dichten sowohl für pro-MMP-2 und MMP-2.
Discussion
Wir haben gezeigt, wie man zymographische Analyse der MMP-2 in Zellkulturüberständen durchzuführen.
Die Höhe der Probe auf ein Gel Last muss empirisch ermittelt je nach Herkunft und MMP von Interesse sein. Lädt zu wenig wird Erkennung verhindern beim Laden zu viel kann bis zur Sättigung führen, da es nur so viel Substrat einer Protease im Bereich der Band verdauen können. Falls erforderlich, kann die Probe in deionisiertem Wasser vor dem Mischen mit Ladepuffer oder die Entwicklungszeit verdünnt werden kann de reduziert von über Nacht bis 4 Stunden. Es ist auch möglich, Proteine in einer Lösung mit Konzentratoren (zB Millipore Katalog # UFC803024) konzentrieren. Wenn Bands kaum sichtbar bleiben, kann es notwendig sein, um die Gele für einen längeren Zeitraum zu entwickeln, auch bis zu 48 Stunden. Bei der Vorbereitung Proben aus Zellkultur-Überstände, darauf hinzuweisen, dass fötales Rinderserum (und andere Seren) MMPs, dass die Ergebnisse beeinflussen können, enthält. Aus diesem Grund erheben wir alle unsere Überstände nach der Kultur in serum-freiem Medium.
Die Waschungen in den Absätzen 2.9 und 2.10 des Protokolls beschrieben sind notwendig, um die Hintergrundfärbung der verdauten Bands entfernen. Längere Waschzeiten löscht mehr Hintergrund, sondern auch dim die Färbung des Substrates durch das Gel. Wenn mehr Waschzeiten notwendig sind, empfehlen wir das Scannen des Gels alle paar Stunden, um den Scan mit dem besten Kontrast zu wählen.
Diese Technik kann verwendet werden, um andere MMPs zu erkennen. Zum Beispiel kann MMP-9 auf Gelatine-Gelen nachgewiesen werden, und auch in geringerem Umfang MMP-1, MMP-8 und MMP-13 wie Gelatine ist nicht ihr bevorzugtes Substrat. MMP-1 und MMP-13 sind am besten auf Kollagen Zymographie erkannt, während Kasein ist das bevorzugte Substrat für die MMP-11 und ermöglicht auch den Nachweis von MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 und MMP-13 9. MMP-7 (Matrilysin) und Kollagenasen (MMP-1 und MMP-13) sind schwer zu erkennen, wenn in geringen Mengen in Kasein oder Gelatine-Gelen. Die Zugabe von Heparin auf die Probe zum Zeitpunkt der Gel-loading verbessert die Nachweisgrenze für MMP-7. Für MMP-1 und MMP-13, muss das Heparin zu dem Gel nach der elektrophoretischen Lauf ist bereits im Gange 12.
Da Zymographie Maßnahmen enzymatische Aktivität nach Denaturierung und Renaturierung der Enzyme, wird es messen die Aktivität aller MMPs in der Probe vorhanden. Dies sind Enzyme, Pro-Enzyme und Enzyme gebunden endogenen Inhibitoren (zB TIMP-2). Es ist jedoch möglich, das Niveau der MMP Aktivierung in der Probe durch den Vergleich der Band Dichte des aktiven Enzyms und dass der Pro-Enzym, das einen etwas höheren Molekulargewicht bestimmen.
Zymographie ist oft nicht ausreichend, um eine MMP zu identifizieren. Vergleich der Höhe der Migration eines MMP mit bekanntem Molekulargewicht-Standards ist bei der Identifizierung helfen, aber es sei darauf hingewiesen, dass einige dieser Standards ein Reduktionsmittel enthalten, und dass, wenn sie unter nicht-reduzierenden Bedingungen verwendet sie unterschiedliche Molekulargewichte 9 geben werden. Eine Option ist, um eine lösliche rekombinante MMP auf dem gleichen Gel als die Prüflinge zu laden. MMPs kann jedoch mit anderen Proteinen assoziiert sein, Induktion einer Änderung der scheinbaren Molekulargewicht. Selektive MMP-Inhibitoren kann das Gel (oder ein Teil eines Gels halbiert) während der Inkubation in der Entwicklung Puffer als pharmakologische Werkzeuge, um die Identität hinzugefügt werden die MMP von interest.A zweite Technik (Western Blot, Immunzytochemie, oder ELISA) zu empfehlen Hilfe bei der Identifizierung der MMP von Interesse. Anzumerken ist, dass Nachweisgrenzen für Western Blots oft viel niedriger als die der zymographische Gele, was möglicherweise zu falsch-negative Ergebnisse bei der Verwendung dieser Technik werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Dr. S. Ressler (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) für die Annahme, die Verwendung von Protein-Konzentratoren, um die Konzentration von MMPs in Zellkulturüberständen erhöhen danken.
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH / NIAMS (AR059838) zu CB unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
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