Summary
Detta protokoll beskriver en aktivitet-baserad analys för detektion av metalloproteinaser i kultur supernatanterna eller kroppsvätskor.
Abstract
Metalloproteinaser (MMPs) är zink-innehållande endopeptidaser. De bryts ned proteiner genom klyvning av peptidbindningar. Mer än tjugo MMPs har identifierats och är uppdelade i sex grupper baserat på deras struktur och substrat specificitet (collagenases, gelatinases, membrantyp [MT-MMP] stromelysins, matrilysins och andra). MMPs spelar en avgörande roll i cell invasion, brosk nedbrytning, vävnad remodeling, sårläkning och fosterutveckling. De deltar därför i både normala processer och i patogenesen av många sjukdomar, såsom reumatoid artrit, cancer eller kronisk obstruktiv lungsjukdom 1-6. Här kommer vi att fokusera på MMP-2 (gelatinase A, typ IV kollagenas), ett allmänt uttryckt MMP. Vi kommer att visa hur man upptäcker MMP-2 i supernatanter cellodling av zymography, ett vanligt, enkelt, och ändå mycket känslig teknik som först beskrevs 1980 av C. Heussen och EB Dowdle 7-10. Denna teknik är semikvantitativ kan det därför användas för att bestämma MMP nivåer i proverna då kända koncentrationer av rekombinant MMP lastas på samma gel 11.
Lösningar som innehåller MMPs (t.ex. cellodling supernatanterna, urin eller serum) lastas på en polyakrylamidgel innehåller natriumdodecylsulfat (SDS, att linjärisera de proteiner) och gelatin (substrat för MMP-2). Provet bufferten är utformad för att öka prov viskositet (för att underlätta gel lastning), ger en spårning färgämne (Bromfenolblått, att övervaka prov migration), ger denatureringen molekyler (till linjärisera proteiner), och kontrollera pH-värdet i provet. Proteiner är då tillåtet att flytta under en elektrisk ström i en löpande buffert för att ge en konstant migration hastighet. Avståndet migration är omvänt korrelerad med molekylvikt av proteinet (små proteiner rör sig snabbare genom gelen än stora proteiner och därför vandrar längre ner gelen). Efter migreringen är gelen placeras i en renaturing buffert så att proteiner för att återvinna sin tertiära struktur som behövs för enzymatisk aktivitet. Gelen placeras sedan i ett u-buffert för att låta proteaset att smälta sitt substrat. Utvecklingsländerna bufferten innehåller också p-aminophenylmercuric acetat (APMA) för att aktivera den icke-proteolytiska pro-MMPs till aktiva MMPs. Nästa steg består av färgning av substrat (gelatin i vårt exempel). Efter tvättning av överflödig färg bort gel, områden proteas matsmältningen visas som tydligt band. Ju tydligare bandet, mer koncentrerad proteaset den innehåller. Band färgningsintensitet kan sedan bestämmas genom densitometri, med hjälp av ett program som ImageJ, vilket möjliggör prov jämförelse.
Protocol
1. Lastning och köra Gel
- Alla prover måste vara beredda tillräckligt för att upprätthålla funktionen hos enzymer och användas omedelbart efter samlingen, eller förvaras frysta vid -80 ° C. Proverna får inte innehålla reduktionsmedel (t.ex. en β-merkaptoetanol) eller kokas innan de laddas på gelen.
- Öppna påsen innehåller en gel inuti en kassett, skölj kassett med avjoniserat vatten.
- Ta bort skyddstejpen från botten av kassetten och kammen från toppen av gelen.
- Skölj brunnarna tre gånger med löpande buffert (utspädd till 1X i avjoniserat vatten).
- Placera gelen i mini-Cell, se till att den minsta sidan av kassetten ansiktena inåt. Lås på plats med Gel Tension Wedge. Mini-Cell gör det möjligt att köra en eller två geler parallellt.
- Fyll upp (inuti) kammare med 1X löpande buffert ovanför brunnar nivå, kontrollera eventuella läckage. I händelse av läckage, ta bort bufferten och flyttar gelen.
- Fyll den nedre kammaren med 1X löpande buffert.
- Belastning 10 mikroliter av protein molekylär markör i en brunn.
- Blanda en lika stor mängd gel-loading buffert och prov och ladda in i brunnarna i gelen med hjälp av gel-lastning tips (ändras mellan varje prov). Dessa brunnar kan laddas med upp till 20 mikroliter totalt.
- Placera locket på Mini-Cell och ansluta elektroden sladdar till elnätet. Slå på strömmen och ställ in den att köra på 125 V konstant i 90 minuter. Kontrollera att det bildas små bubblor på tråd av den lägre kammaren, som visar aktuella cirkulationen.
- När du kör din första gel, övervaka utvecklingen av migrationen var 15 minuter, med hjälp av Bromfenolblått ingår i den buffert som indikator. Låt gelen löper tills indikatorn dye når botten av gelen.
2. Renaturing och utveckla Gel
- För varje gel, bereda 100 ml 1X renaturing buffert och 200 ml denaturering buffert, både i avjoniserat vatten.
- När Bromfenolblått spårning dye når botten av gelen, slå på strömmen av, öppna Mini-Cell och ta bort gelen. Separera de två sidorna av kassetten med gel kniv (eller en som väger spatel). Skär ett hörn för att markera gelen riktning.
- Ta försiktigt bort gelen ur kassetten och placera i en behållare med 100 ml renaturing buffert. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Ta bort renaturing buffert och tillsätt 100 ml utveckla buffert för gelen. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Ta bort utveckla buffert och tillsätt 100 ml mer för att utveckla buffert för gelen. Inkubera över natten (16-18 timmar) vid 37 ° C.
- Ta bort utveckla buffert och skölj tre gånger (5 minuter) med avjoniserat vatten under försiktig omrörning i rumstemperatur.
- Skanna gelen att spara exakt positionering av banden proteinet standard som de kommer att bli mindre eller inte syns efter gel färgning.
- Fläck gelen genom att tillsätta 20 ml SimplyBlue Safestain på gelen. Inkubera 1 timme vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Ta bort SimplyBlue SafeStain och de-fläck gelen i 100 ml eller mer avjoniserat vatten i en timme vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- För bättre resultat, ersätta med nytt avjoniserat vatten och inkubera under ytterligare en timme eller mer vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
3. Data Analysis
- Ta försiktigt bort gelen från vattnet och lägg i en plast beskyddare.
- Scan gelen med en upplösning på 300 dpi eller högre. Spara bilden i TIFF-format (Figur 1A).
- Mät band intensiteter med ImageJ (eller någon annan liknande programvara).
- Öppna TIFF-filen i ImageJ (Figur 1A).
- Visualisera i svart och vitt genom att välja "Image> typ> 8-bitars" (Figur 1B).
- Använd den rektangulära markeringsverktyget för att beskriva det första bandet, dra en rektangel minst två gånger högre än den är bred (detta är en programvara krav).
- Tryck på "1" eller välj "Analyze> Geler> Välj första lane" och bandet kommer att beskrivas.
- En ny rektangel visas, flytta den till nästa band och välj "Analyze> Geler> Välj nästa lane". Upprepa tills alla band väljs (Figur 1B).
- Tryck "3" eller välj "Analyze> Geler> Tomt körfält" för att generera den profil plotten för varje band (Figur 1C).
- Använd den raka linjeval (borde redan vara automatiskt) för att dra baslinjerna så att peak av intresse är en helt sluten yta.
- Välj trollspö verktyget och klicka i varje topp att markera det.
- Välj "Analyze> Geler> Label toppar" för att få ett bord med området för varje topp. Dessa data kan ritas som sådan (Figure 1D) eller kan normaliseras till värdet av en vald band. Denna normalisering är särskilt viktigt när sammanslagning värden från flera replikera geler att bestämma statistisk signifikans av resultaten.
4. Representativa resultat
Vi visar en gel med 11 brunnar laddad med olika supernatanter cellkulturer som innehåller olika mängder MMP-2 (Figur 1A). Direkt observation av denna gel visar tydliga skillnader i MMP-2 koncentrationer mellan några av brunnarna. Till exempel är det tydligt att brunnar # 4 och 5 innehåller mycket mer MMP-2 än väl # 11 eller ens bra # 10. För objektiv kvantifiering av band som vi har använt densitometri med ImageJ programvara (Figur 1B-D), vilket bekräftar en 4-faldig skillnad i MMP-2 belopp mellan brunn nr 11 och brunnar # 4 och 5 och en ungefär 2-faldig skillnad i MMP-2 belopp mellan brunn nr 10 och brunnar # 4 och 5.
Figur 1. Upptäckt av MMP-2 med gelatin zymography. A, skannad bild av ett gelatin gel. Tja nummer anges på toppen av gelen. B, samma gel som i en visas i svart och vitt för densitometri. Varje band har valts med en rektangel i ImageJ. C Två exempel på densitometri profiler för gelen som visas i A och B (band # 4 och # 11). En rak linje drogs vid basen av varje topp för att skapa ett stängt område. D, Rita på toppen områden för gelen som visas i A och B före (vänster) och efter (höger) normalisering och densiteten av bandet # 1.
Figur 2. Siffran visar hur zymography kan användas som en semi-kvantitativ teknik. Vi har laddat spädningar (steg 1:01 spädningar) i 7 på varandra följande brunnar och mätte bandet densiteter för både pro-MMP-2 och MMP-2.
Discussion
Vi har visat hur man utför zymographic analys av MMP-2 i supernatanter cellkultur.
Mängden prov till lasten på en gel måste bestämmas empiriskt beroende på ursprung och MMP av intresse. Laddar för lite kommer att förhindra upptäckt, läser för mycket kan leda till mättnad eftersom det bara finns så mycket substrat ett proteas kan smälta inom bandet. Vid behov kan provet spädas med avjoniserat vatten innan de blandas med buffert eller i utvecklingsländerna tid kan de minskat från natten till 4 timmar. Det är också möjligt att koncentrera proteiner i en lösning med koncentratorer (t.ex. Millipore katalog # UFC803024). Om banden fortfarande knappt synliga, kan det vara nödvändigt att utveckla geler under en längre tid, ända upp till 48 timmar. När man förbereder prover från supernatanter vävnadsodling, bör det noteras att fetalt bovinserum (och andra serum) innehåller MMPs som kan påverka resultaten. Av den anledningen samlar vi alla våra supernatanter efter kultur i serumfritt medium.
De tvättar som beskrivs i punkterna 2.9 och 2.10 i protokollet är nödvändigt att ta bort bakgrundsfärgning av smält band. Längre tvätta gånger kommer att ta bort mer bakgrund, men kommer också att dämpa färgning av substrat i hela gelen. Om längre tvätta tider är nödvändiga, rekommenderar vi att skanna gelen varannan timme för att välja skanna med den bästa kontrasten.
Denna teknik kan användas för att upptäcka andra MMPs. Till exempel kan MMP-9 kan upptäckas på gelatin geler, och även till en lägre grad MMP-1, MMP-8, och MMP-13 som gelatin är inte deras bästa substrat. MMP-1 och MMP-13 detekteras bäst på kollagen zymography medan kasein är att föredra substrat för MMP-11 och även gör det möjligt för detektion av MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 och MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) och collagenases (MMP-1 och MMP-13) är svåra att upptäcka när de förekommer i låga nivåer i kasein eller gelatin geler. Tillägg av heparin till provet vid tidpunkten för gel lastning förbättrar avsevärt detektionsgränsen för MMP-7. För MMP-1 och MMP-13, måste heparin läggas till gelen efter elektrofores köra pågår redan 12.
Eftersom zymography åtgärder enzymatisk aktivitet efter denaturering och Återställande av de enzymer, kommer det att mäta aktiviteten hos alla MMPs i provet. Detta omfattar enzymer, pro-enzymer, och enzymer bundna till endogen hämmare (t.ex. TIMP-2). Det är dock möjligt att bestämma nivån av MMP aktivering i provet genom att jämföra bandet tätheten av aktiva enzymet och av den för den pro-enzym, som kommer att ha en något högre molekylvikt.
Zymography är ofta inte tillräckligt för att identifiera en MMP. Jämförelse av migration en MMP med känd molekylvikt standarder hjälper till att identifiera, men det bör noteras att vissa av dessa standarder innehåller ett reduktionsmedel och som när de används under icke-reducerande förhållanden de kan visa på olika molekylvikt 9. Ett alternativ är att ladda ett lösligt rekombinant MMP på samma gel som proverna. MMPs kan dock vara förknippade med andra proteiner, förmå en förändring i uppenbar molekylvikt. Selektiva MMP-hämmare kan läggas till gelen (eller del av en gel halveras) under inkubationstiden för att utveckla buffert som farmakologiska verktyg för att identifiera de MMP av interest.A andra tekniken (Western Blot, immuncytokemi eller ELISA) rekommenderas att hjälp i identifieringen av MMP av intresse. Det bör noteras att detektionsgränserna för Western blotting ofta är mycket lägre än zymographic gel, vilket kan leda till falskt negativa resultat när man använder denna teknik.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr S. Ressler (Institutionen för molekylär och cellulär biologi, Baylor College of Medicine) för att föreslå användning av protein koncentratorer för att öka koncentrationen av MMPs i supernatanter cellkultur.
Projektet har finansierats med bidrag från Mrs Clifford Elder Vit Graham Begåvad forskningsfonden och NIH / NIAMS (AR059838) till CB. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | |
| Power supply (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Gel loading tips | VWR international | 53509-015 | |
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
