Summary
Abstract
We tonen de basistechnieken voor presynaptische patch clamp opname op de kelk van de Held, een centrale zenuwstelsel zenuwuiteinde. Elektrische opnames van de presynaptische terminal kan de meting van actiepotentialen, calcium kanaal stromen, vesicle fusie (exocytose) en de daaropvolgende membraan opname (endocytose). De fusie van de blaasjes met neurotransmitter zorgt ervoor dat het blaasje membraan te worden toegevoegd aan de celmembraan van de kelk. Deze toename van de hoeveelheid van de celmembraan wordt gemeten als een toename van de capaciteit. De daaropvolgende daling van de capaciteit geeft endocytose, het proces van het membraan opname of verwijdering uit de kelk membraan. Endocytose, is nodig om de structuur van de kelk te behouden en het is ook nodig om blaasjes die zal worden gevuld met neurotransmitter voor de toekomst exocytose gebeurtenissen vormen. Capaciteit opnames op de kelk van de Held hebben het mogelijk gemaakt om rechtstreeks en snel te meten vesiculaire release en de daarna endocytose in een zoogdier CZS zenuwuiteinde. Daarnaast kan de bijbehorende postsynaptische activiteit gelijktijdig worden gemeten met behulp van gepaarde opnames. Dus een compleet beeld van de presynaptische en postsynaptische elektrische activiteit op een centrale zenuwstelsel synaps is haalbaar met deze voorbereiding. Hier worden de methoden voor slice voorbereiding, morfologische kenmerken voor de identificatie van kelken van de Held, basic patch klem technieken en voorbeelden van capaciteit opnames naar exocytose en endocytose te meten gepresenteerd.
Protocol
Patch Clamp Setup:
Optiek: De optiek is zeer belangrijk om een goede cel te vinden, en om de positie van het vast te stellen.
Probeer een duidelijk beeld van de cellen te krijgen: scherpe randen, soft-kijken cel.
Scannen het hele veld om te zoeken naar een goede MNTB belangrijkste cellen met aangehechte kelk. Draai schotel te kijken naar kelken vanuit verschillende invalshoeken. In het begin is het OK om te oefenen op ballon-vormige terminal.
Pick-cel aan het oppervlak van slice, of in de 2 e cellaag. Doel van de eerste 1 / 3 van cel met pipet
Het identificeren van kelken: Kijk voor een dubbele membraan (zie figuur 1), en draai de plak schotel om het te zien vanuit verschillende invalshoeken om te helpen dat het een kelk te bevestigen.
Figuur 1
Diepte van Calyx: Calyx moet worden op het oppervlak of als aan het oppervlak als mogelijk te sluiten.
Oppervlak beschikbaar voor het patchen: Gebruik fine-focus knop op microscoop om te bepalen hoe 'breed / diep "de kelk is. Zo zal bijvoorbeeld ~ 10% van een hele draai op het scherpstellen geeft je meer dan genoeg oppervlakte om pleister op.
Afdichting op een presynaptische cel: Om naar cel aangehecht, op zoek naar een "kleine" vervorming op het celoppervlak te wijten aan pos druk (~ 0.15psi) in de pipet, gebruik manipulator te pipet lopen omhoog, omlaag en over, en zelfs in het oppervlak van de presyn terminal om een goede vervorming te krijgen, laat dan druk-en afzuigen, indien en voor zover nodig.
PULSE, data-acquisitie programma:
Moet buffer groter maken voor het eerste gebruik, en wanneer nodig door middel van steekproeven capaciteit.
Noodzaak om te laden aangepaste macro's per keer.
Vloeistof Junction Potentiële: Presyn recording oplossing is-11mV (negatieve 11mV).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp voor presyn: 10 μsec, 65% (meer compensatie mogelijk w / out oscillaties)
Voordat u de opname capaciteit: Test huidige ontspanning (10 mV, 10 msec springen) om te zien of ontspanning monoexponential is, dat wil zeggen, of presyn term kan worden gemodelleerd door een enkele ruimte.
Filters: Stel bij 30 kHz en 10 kHz (Bessel-filter 1 en 2 respectievelijk) tijdens ontspanning meten, om er zeker van een snelle component is niet gemist.
Tijdens de mini-opnames, Xinsheng gebruikt 10 kHz en 5kHz. LGW vroeg me om slechts 1 set filter gebruiken 30 kHz om ervoor te zorgen dat we kunnen stijgen-time meten van de mini.
Bestanden benoemen: 7 cijfers 000mmxx, waar mm maand (of maand en jaar) en de xx is het aantal cellen.
Cleaning Solution Lines: Lijnen gereinigd aan het einde van het experiment met 20 ml 0,1 M HCl gevolgd door 200 ml ddH2O.
Externe oplossingen worden gerecycled, toerental van de pomp is 20-30 tpm.
(Oplossing die terugkeerden van bad kamer stroomt terug in de maatcilinder).
Stel drie uitgaande lijnen om voldoende afzuiging te garanderen.
Pipetteer presynaptische opname Oplossing: ~ 310 milli osmolaire
Presyn oplossing dient te worden ~ 310 mOsm naar R-toegang tot verhoging te voorkomen tijdens experiment.
Presyn pipet oplossing is verschillend van postsyn pipet-oplossing (Presyn heeft ATP en GTP voor ex.).
TTX-TEA Solution (Ca stroom isoleren):
- Proberen toe te passen na de sluiting, of zelfs patching, op de cel, zoals TEA in oplossing blokken K-kanalen en depolariseert de cel. Dat is niet goed voor de cel. Om dezelfde reden, zou het niet mogelijk om het plakje opnieuw te gebruiken nadat TTX is toegepast.
- Vergelijk de eerste en de laatste reactie van de cel, of slice om te controleren voor elk effect van langdurige depolarisatie.
- TTX wordt gebruikt bij 1 uM in plaats van 0,5 uM, zodat het effect is sneller. Wilt u minder tijd te wachten na het vervangen van oplossingen.
Snijden Slices
Vibratome instellingen:
- 70Hz laterale trillingen
- Amplitude: 1,0 mm
- Voorwaartse snelheid 0.01-0.02 mm / sec tijdens het snijden plakken met kelk, 0,1 anders dikte: 180 pm (~ 150um bij oudere dieren)
Slices incuberen bij 37 º C gedurende 1 uur (inclusief snijden tijd), dat wil zeggen, laat in bad 15-20 minuten na het snijden.
Pipetten:
Presyn: 3.5-4.5 MΩ in het begin, 3.0-3.5 MΩ wanneer meer zelfvertrouwen
Gebruik trekker handleiding om in te stellen. Gebruik vertraging functie, want glas is dik (vertraging van 200 of een werk)
Glas type: Borosilicate, standaard muur, geen gloeidraad
Outer Diameter: 2,0 mm
Inner Diameter 1,16 mm
Lengte: 7,5 cm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
