Summary
Abstract
Dimostriamo le tecniche di base per la registrazione presinaptico patch clamp al calice di Held, un mammifero terminali nervosi del sistema nervoso centrale. Registrazioni elettrico dal terminale presinaptico consentire la misurazione dei potenziali d'azione, correnti dei canali del calcio, fusione delle vescicole (esocitosi) e l'assorbimento della membrana successivi (endocitosi). La fusione di vescicole contenenti neurotrasmettitori provoca la membrana delle vescicole da aggiungere alla membrana cellulare del calice. Questo aumento della quantità di membrana cellulare è misurato come un aumento della capacità. La conseguente riduzione di capacità indica endocitosi, il processo di assorbimento della membrana o la rimozione dalla membrana calice. Endocitosi, è necessario mantenere la struttura del calice ed è anche necessario formare vescicole che verrà riempito di neurotrasmettitore per esocitosi eventi futuri. Registrazioni capacità al calice di Held hanno permesso di misurare direttamente e rapidamente rilascio vescicolare e endocitosi successivo in un nervo terminale nervoso centrale dei mammiferi. Inoltre, la corrispondente attività postsinaptica possono essere contemporaneamente misurata utilizzando le registrazioni appaiati. Così un quadro completo dell'attività presinaptica e postsinaptica elettrica presso una sinapsi del sistema nervoso centrale è realizzabile utilizzando questa preparazione. Qui, i metodi di preparazione fetta, caratteristiche morfologiche per l'identificazione dei calici di Held, tecniche di patch di base di fissaggio, ed esempi di registrazioni capacità di misurare esocitosi e endocitosi sono presentati.
Protocol
Patch Morsetto di installazione:
Ottica: Le ottiche sono molto importanti per trovare un buon cellulare, e di stabilire la posizione di esso.
Cercare di ottenere un'immagine chiara delle cellule: spigoli vivi, morbida dall'aspetto delle cellule.
Scansione tutto il campo per cercare una buona cellule MNTB principale con calice allegato. Ruotare piatto per cercare calici da diverse angolazioni. In un primo momento, va bene la pratica sul palloncino a forma di terminale.
Scegli cellule sulla superficie della fetta, o nello strato 2 ° cell. Obiettivo il primo 1 / 3 ° di cellulare con pipetta
Identificare calici: Cercare una doppia membrana (vedi Figura 1), e ruotare il piatto fetta di vederlo da diverse angolazioni per aiutare a confermare che si tratta di un calice.
Figura 1
Profondità di calice: calice dovrebbe essere sulla superficie o il più vicino alla superficie possibile.
Superficie disponibile per l'applicazione di patch: Utilizzare messa a fuoco manopola sul microscopio per determinare come "larghezza / profondità" il calice è. Per esempio, ~ 10% di un giro completo sulla messa a fuoco fine vi darà più di una superficie sufficiente per cerotto sulla.
Di tenuta su una cellula presinaptica: Per arrivare alla cella collegata, cercare una deformazione "piccolo" sulla superficie delle cellule a causa della pressione pos (~ 0.15psi) nella pipetta, usare manipolatore per eseguire pipetta su, giù e su, e anche in la superficie del terminale presyn per ottenere una deformazione buona, poi rilasciare la pressione di aspirazione e di applicare, se e quando necessario.
PULSE, acquisizione dati del programma:
Necessità di aumentare la dimensione del buffer prima del primo utilizzo, e ad ogni richiesta la capacità di campionamento.
Bisogno di caricare le macro modificato ogni volta.
Potenziale di giunzione liquida: soluzione di registrazione Presyn è-11mV (11mV negativo).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp per presyn: 10 msec, il 65% (più l'indennità possibile w / out oscillazioni)
Prima di capacità di registrazione: relax Corrente di prova (10 mV, 10 msec salto) per vedere se il relax è monoesponenziale, cioè se presyn termine può essere modellato da un unico vano.
Filtri: Situato a 30 kHz e 10 kHz (filtro di Bessel 1 e 2) durante la misurazione di rilassamento, per assicurarsi un componente veloce non è lasciato sfuggire.
Durante le registrazioni mini, Xinsheng usato 10 kHz e 5 kHz. LGW mi ha chiesto di utilizzare solo filtro 1 fissato a 30 kHz per assicurarsi che possiamo misurare tempo di salita di mini.
I file di denominazione: 7 cifre 000mmxx, dove mm è il mese (o mese e anno) e xx è il numero delle cellule.
Pulizia Linee Soluzione: Linee pulite a fine esperimento con 20 ml di HCl 0,1 M seguita da 200 ml ddH2O.
Soluzioni per esterni vengono riciclati, velocità della pompa è di 20-30 giri al minuto.
(Soluzione di ritorno dalla camera bagno rifluisce nel cilindro graduato).
Istituito 3 linee in uscita per garantire la sufficiente aspirazione.
Aggiunta della soluzione di Presinaptico di registrazione: ~ 310 millisecondi osmolare
Soluzione Presyn deve essere ~ 310 mOsm per impedire l'accesso R-aumentare nel corso dell'esperimento.
Presyn soluzione pipetta è diverso da postsyn pipetta soluzione (Presyn è ATP e GTP ad es.).
TTX-TEA Solution (per isolare le correnti Ca):
- Tenta di applicare dopo la chiusura, o anche patch, sul cellulare, come TEA in blocchi soluzione K-canali e depolarizza la cellula. Questo non è buono per la cellula. Per lo stesso motivo, potrebbe non essere possibile riutilizzare la fetta dopo TTX è applicato.
- Confrontare la risposta prima e l'ultima della cellula, o slice per verificare eventuali effetti di depolarizzazione prolungata.
- TTX viene utilizzato a 1 micron invece di 0,5 mM quindi l'effetto è più veloce. Bisogno di aspettare meno tempo dopo aver cambiato le soluzioni.
Fette di taglio
Vibratome impostazioni:
- 70Hz vibrazioni laterali
- Ampiezza: 1,0 mm
- Velocità di avanzamento 0,01-0,02 mm / sec, mentre il taglio fette con calice, 0,1 altrimenti spessore: 180 micron (~ 150micron di animali più vecchi)
Fette di incubare a 37 ° C per 1 ora (include il tempo di taglio), cioè, lasciare a bagno 15-20 minuti dopo il taglio.
Pipette:
Presyn: 3,5-4,5 MΩ in un primo momento, 3,0-3,5 MΩ quando si sentono più sicuri
Uso manuale estrattore per impostare le impostazioni. Utilizzare la funzione di ritardo perché il vetro è di spessore (ritardo di 200 o 1 lavoro)
Tipo di vetro: borosilicato, parete standard, nessun filamento
Diametro esterno: 2,0 mm
Diametro interno 1,16 millimetri
Lunghezza: 7,5 cm
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