Summary
Abstract
Demonstramos as técnicas básicas para a gravação pré-sináptica patch-clamp no cálice de Held, um terminal de nervo do sistema nervoso central de mamíferos. Gravações elétrica do terminal pré-sináptico permitem a medição de potenciais de ação, as correntes dos canais de cálcio, fusão das vesículas (exocitose) e absorção da membrana subseqüentes (endocitose). A fusão das vesículas contendo neurotransmissor faz com que a membrana da vesícula para ser adicionado à membrana celular do cálice. Este aumento na quantidade de membrana celular é medida como um aumento na capacitância. A redução subsequente na capacitância indica endocitose, o processo de captação de membrana ou remoção da membrana cálice. Endocitose, é necessário manter a estrutura do cálice e também é necessário para formar vesículas que será preenchido com neurotransmissor para eventos exocitose futuro. Gravações de capacitância no cálice de Held tornaram possível a direta e rapidamente medida liberação vesicular e endocitose subseqüentes em um terminal de mamíferos CNS nervosas. Além disso, a atividade correspondente pós-sinápticos podem ser medidos em simultâneo usando gravações emparelhados. Assim, um quadro completo da atividade pré-sináptica e pós-sináptica elétrica em uma sinapse do sistema nervoso central é viável o uso desta preparação. Aqui, os métodos para a preparação fatia, características morfológicas para a identificação de cálices de Held, patches técnicas básicas de fixação, e exemplos de gravações para medir a capacitância exocitose e endocitose são apresentados.
Protocol
Setup Grampo patch:
Óptica: A ótica é muito importante encontrar um celular bom, e para estabelecer a posição dele.
Tentar obter uma imagem clara das células: bordas afiadas, soft-olhando celular.
Digitalizar todo o campo para procurar boas MNTB células principais com cálice em anexo. Prato girar para procurar cálices de diferentes ângulos. Na primeira, ele está OK para a prática do balão em forma de terminal.
Escolha de células na superfície da fatia, ou na camada de células 2 ª. Alvo da rd 03/01 primeiro celular com pipeta
Identificar cálices: Procure uma membrana dupla (ver figura 1) e gire o prato fatia para vê-lo de ângulos diferentes para ajudar a confirmar que é um cálice.
Figura 1
Profundidade da Calyx: Calyx deve estar na superfície ou o mais próximo à superfície possível.
De superfície disponível para aplicação de patches: Use o foco fino botão no microscópio para determinar como "wide / deep" o cálice é. Por exemplo, ~ 10% de uma volta completa sobre o foco fino lhe dará mais de área de superfície suficiente para corrigir em.
Vedação em uma célula pré-sináptica: Para chegar ao celular ligado, procure uma deformação "pequeno" na superfície da célula, devido à pos de pressão (~ 0.15psi) na pipeta, use manipulador para executar pipeta cima, para baixo e em frente, e até mesmo em a superfície do terminal presyn para obter uma deformação bom, em seguida, solte a pressão e sucção, se e quando necessário.
PULSE, dados do programa de aquisição:
Necessidade de aumentar o tamanho do buffer antes da primeira utilização e, sempre que exigido pela capacidade de amostragem.
Necessidade de carregar macros modificado a cada vez.
Junção Potencial líquido: Solução de Gravação Presyn é-11mV (11mV negativo).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp para presyn: 10 ms, 65% (mais possível a compensação pode w / out oscilações)
Antes de capacitância de gravação: relaxamento Corrente de teste (10 mV, 10 ms salto) para ver se o relaxamento é monoexponencial, ou seja, se presyn prazo pode ser modelado por um único compartimento.
Filtros: Situado a 30 kHz e 10 kHz (Bessel filtro 1 e 2, respectivamente) durante a medição de relaxamento, para ter certeza de um componente rápido não é perdido para fora.
Durante as gravações mini, Xinsheng usado 10 kHz e 5 kHz. LBV me pediu para usar apenas 1 conjunto de filtro de 30 kHz para ter certeza de que podemos medir tempo de subida de mini.
Nomear arquivos: 7 dígitos 000mmxx, onde mm é o mês (ou mês e ano) e xx é o número de células.
Linhas de limpeza Solução: Linhas limpas no final do experimento com 20 ml de 0,1 M HCl seguido por 200 ml ddH2O.
Soluções externas são reciclados, a velocidade da bomba é 20-30 rpm.
(Solução de retornar da câmara de banho flui de volta para o cilindro graduado).
Criar três linhas de saída para garantir sucção suficiente.
Adição da solução de gravação pré-sináptica: ~ 310 milli Osmolar
Solução Presyn precisa ser ~ 310 mOsm para impedir R acesso aumentam durante a experiência.
Presyn solução pipeta é diferente de postsyn pipeta solução (Presyn tem ATP e GTP por ex.).
TTX-TEA Solução (para isolar Ca correntes):
- Tentar aplicar após a selagem, ou mesmo o patch, para a célula, como TEA em blocos solução K-canais e despolariza a célula. Isso não é bom para a célula. Pela mesma razão, pode não ser possível a reutilização da fatia após TTX é aplicada.
- Compare a resposta primeiro e último da célula, ou uma fatia para verificar se há algum efeito de despolarização prolongada.
- TTX é utilizada até 1 mM em vez de 0,5 mM de modo que o efeito é mais rápido. Necessidade de esperar menos tempo depois de mudar soluções.
Fatias de corte
Vibratome configurações:
- 70Hz vibrações laterais
- Amplitude: 1,0 milímetros
- A velocidade de avanço 0,01-0,02 mm / seg, enquanto corta fatias de cálice, 0,1 espessura de outra forma: 180 M (~ 150M em animais mais velhos)
Fatias de incubar a 37 º C por 1 hora (inclui o tempo de corte), ou seja, deixar em banho de 15-20 minutos após o corte.
Pipetas:
Presyn: 3,5-4,5 mohms num primeiro momento, 3,0-3,5 mohms quando se sentir mais confiante
Uso manual extrator para definir as configurações. Use recurso de atraso porque o vidro é grosso (atrasos de 200 ou um trabalho)
Vidro tipo: borosilicato, padrão parede, nenhum filamento
Diâmetro externo: 2,0 mm
Diâmetro interno 1,16 milímetros
Comprimento: 7.5 cm
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