Summary
इस प्रोटोकॉल एक कंकाल की मांसपेशियों से अलग mitochondria की श्वसन का अध्ययन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है. इस विधि Scorrano से अनुकूलित किया गया था
Protocol
1. Buffers की तैयारी
- अपकेंद्रित्र 5804R पर मुड़ें और 4 करने के लिए सेट ° सी. Isotemp 3006D पानी स्नान और सेट पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मुड़ें
- मांसपेशी अलगाव से पहले निम्न समाधानों की तैयारी:
- पीबीएस: आसुत जल (5 गोलियाँ लीटर /) में बफर फॉस्फेट खारा गोलियाँ (पीबीएस) भंग. अच्छी तरह मिक्स.
- पीबीएस प्लस 10 मिमी EDTA: एक 100 मिलीलीटर समाधान तैयार करने के लिए, पीबीएस के 98 मिलीलीटर के लिए 500 मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ने.
- 8X Mitochondria बफर: 10.28 sucrose के छ 0.6 के अंतिम एकाग्रता एम, मुक्त फैटी एसिड की 400 मिलीग्राम के लिए 0.8% की एक अंतिम एकाग्रता, 160 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2.08 HEPES के छ, पीएच के लिए गोजातीय सीरम albumin (BSA) 7.4 और आसुत जल के साथ 50 मिलीलीटर QS.
- अलगाव एक बफर (IB1): 10 मिमी, 0.392 215 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए डी mannitol जी, 8X mitochondria बफर पीएच के 1.25 मिलीलीटर के लिए 7.4 और QS के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 से 500 मिमी EDTA के 200 μl जोड़ें आसुत जल के साथ मिलीलीटर.
- अलगाव 2 बफर (IB2): 3 मिमी, 0.392 215 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए डी mannitol जी, 8X mitochondria बफर पीएच के 1.25 मिलीलीटर के लिए 7.4 और QS के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 से 500 मिमी EGTA के 60 μl जोड़ें आसुत जल के साथ मिलीलीटर.
- प्रायोगिक बफर (EB): 5 मिमी, 0.392 215 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए डी mannitol जी, 2.5 मिमी की 25 μl के.एच. 2 पीओ 4 के अंतिम एकाग्रता के लिए की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 500 मिमी 2 MgCl के 100 μl जोड़ें 6.25 सुक्ष्ममापी, 20 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए 2 100 मिमी EGTA की μl, mitochondrial बफर, 7.4 पीएच और QS आसुत जल के साथ 10 मिलीलीटर की 1.25 मिलीग्राम.
2. बलवान अलगाव
- एक बर्फ बाल्टी, तीन 10 मिलीलीटर beakers, पॉटर Elvehjem ऊतक grinders और बर्फ पर अन्य सभी आवश्यक उपकरणों की आपूर्ति / डाल दिया. सब कुछ ठंडा प्रयोग भर में रहना चाहिए.
- IB1 और IB2 बर्फ और गर्म पानी से स्नान में बाल्टी EB में जब किया प्लेस.
- तीन 10 मिलीलीटर beakers में, निम्न समाधानों जोड़ा जाना चाहिए:
- 1 बीकर: पीबीएस के 10 मिलीलीटर
- 2 बीकर: पीबीएस / EDTA के 10 मिलीलीटर
- 3 बीकर: IB1 के 3 मिलीलीटर
- Humanely के रूप में अपने स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित चूहे को मार डालो.
- तेजी से कंकाल की मांसपेशी के 250-500 मिलीग्राम अलग, एक बीकर में कुल्ला, तो 2 बीकर को हस्तांतरण.
3. Homogenization / Mitochondrial अलगाव
- 3 बीकर मांसपेशियों के स्थानांतरण और पतले कैंची के साथ मांसपेशियों कीमा.
- पॉटर Elvehjem homogenizer को हल स्थानांतरण. एक motorized मूसल (एक ड्रिल प्रेस काम करेंगे) 10 बार बर्फ में हर समय रखने के ट्यूब का उपयोग मांसपेशियों homogenize.
- 4 में 10 मिनट के लिए 700 ग्राम डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और अपकेंद्रित्र homogenate स्थानांतरण
- एक नया microcentrifuge पूर्व ठंडा ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. गोली त्यागें.
- 4 में 10 मिनट के लिए 10,500 ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- एक नया पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब और लेबल (सतह पर तैरनेवाला संख्या 1) SN1 और मांसपेशियों प्रकार से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- Μl IB2 के 500 में गोली पुनः निलंबित.
- 4 में 10 मिनट के लिए 10,500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- एक नया पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब और लेबल (सतह पर तैरनेवाला संख्या 2) SN2 और मांसपेशियों प्रकार के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- IB2 के 100 μl में अंतिम mitochondrial गोली निलंबित.
- पुन स्पिन कुछ सेकंड के लिए अंतिम minifuge में mitochondrial निलंबन. अगर वहाँ एक गोली है, एक नया microcentrifuge पूर्व ठंडा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.
- ब्रैडफोर्ड 8 परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
4. इलेक्ट्रोड अंशांकन
नोट: mitochondrial अलगाव के दौरान पूरा इलेक्ट्रोड अंशांकन.
- आसुत पानी की 100 मिलीलीटर 250 मिलीलीटर फ्लास्क में जोड़ें. सख्ती से 20 मिनट के लिए हिलाओ वायुमंडलीय गैस के साथ पानी संतुलित.
- 50% की कुछ बूँदें Oxygraph इलेक्ट्रोड के लिए KCl जोड़ें.
- ब्लू Rizla रोलिंग कागज के इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस.
- PTFE झिल्ली की रोलिंग कागज के शीर्ष पर एक टुकड़ा रखें.
- भीतरी अंगूठी अंगूठी applicator का उपयोग कर लागू करें और तब इलेक्ट्रोड नाली में बाहरी रिंग जगह.
- इलेक्ट्रोड कनेक्ट और उपकरणों के बाकी को इकट्ठा: बड़ा प्लास्टिक की अंगूठी का आधार है, mitochondrial कक्ष, और पानी hoses.
- Oxygraph बक्से पर मुड़ें और Oxygraph सॉफ्टवेयर शुरू.
- Mitochondrial चैम्बर equilibrated पानी जोड़ें.
- बार हलचल और 60 की एक गति पर बारी जोड़ें.
- एक नया प्रयोग शुरू करो.
- जांचना पर क्लिक करें और तब बॉक्स 1 के लिए तरल चरण अंशांकन. 37 के लिए तापमान बदलें डिग्री सेल्सियस और "ठीक" दो बार क्लिक करें.
- जब "ओवरराइड" के लिए "ठीक" परिवर्तन इसे क्लिक करें और नाइट्रोजन गैस टैंक खुला.
- प्लेस टिप चेंबर में नाइट्रोजन टैंक से जुड़े और शून्य ऑक्सीजन की स्थापना. सीचाटना "ठीक है" जब से स्विच "ओवरराइड."
- पानी Aspirate और mitochondrial कक्षों EB बफर के 500 μl जोड़ने.
- सवार के साथ सील चैम्बर.
- यदि एकाधिक बक्से का उपयोग, दोहराने बॉक्स 2 के अंशांकन के लिए 11-15 कदम.
5. Mitochondrial श्वसन
- एक नया प्रयोग शुरू करें, के बारे में 1 मिनट के लिए इसे चलाने के लिए संकेत स्थिर.
- प्रत्येक कक्ष में 150 μg, निशान घटना के लिए mitochondrial निलंबन की आवश्यक मात्रा (3.11 कदम) जोड़ें, और इसे 1 मिनट के लिए चला.
- 10 के μl जोड़ें गर्म 250 mM/125 मिमी / 5 mM/2.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लूटामेट Malate. मार्क और 1 मिनट के लिए चलाया. यह राज्य के रूप में 2 में परिभाषित किया गया है.
- 150 सुक्ष्ममापी, निशान के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिमी ADP 7.5 μl जोड़ें, और 30 सेकंड के लिए चलाए जाने. यह 3 राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है.
- 10 मिमी ADP, निशान के एक 7.5 μl जोड़ें, और 1.5 मिनट के लिए चलाने के चलो.
- 1 सुक्ष्ममापी, निशान के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठंड 10 मिमी oligomycin के 0.5 μl जोड़ें, और 3 मिनट के लिए चलाने के चलो. यह 4 राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है.
- 0.2 सुक्ष्ममापी, निशान के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठंड 0.1 मिमी FCCP 1 μl जोड़ें, और 3 मिनट के लिए चलाने के चलो. यह राज्य के रूप में 5 में परिभाषित किया गया है.
- जब समाप्त हो, प्रयोग के अंत में और बचाने के.
- श्वसन Oxygraph सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दरों मोल.
- सामान्य कारक दर्ज करें: अगर mitochondrial प्रोटीन की 150 μg जोड़ने, सामान्य कारक 0.15 हो जाएगा.
- विभिन्न श्वसन राज्यों के लिए सामान्यीकृत श्वसन दर की गणना.
- राज्य 3 4 राज्य द्वारा विभाजित करके श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) की गणना.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 कंकाल mitochondria मांसपेशियों द्वारा ऑक्सीजन की खपत के अनुरेखण प्रतिनिधि से पता चलता है. इलेक्ट्रोड संकेत के बाद स्थिर है, mitochondria नमूना Oxygraph कक्ष में जोड़ा जाता है. राज्य 2 श्वसन ग्लूटामेट और Malate के अलावा के साथ शुरू होता है. ADP के अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है, राज्य को परिभाषित श्वसन 3. राज्य 4 श्वसन प्राप्त एटीपी synthase oligomycin के अलावा द्वारा अवरुद्ध है. अंत में, FCCP mitochondrial श्वसन जुदा करना (5 राज्य) जोड़ा जाता है तालिका 1 राज्यों 2, 3, 4 और 5 के लिए प्रतिनिधि ऑक्सीजन की खपत की दर से पता चलता है.. श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) प्रत्येक प्रयोग के लिए गणना की है. रेसकोर्स रोड ≥ 4 एक व्यवहार्य mitochondria की तैयारी के सबूत के रूप में माना जाता है.
| राज्य अमेरिका | सामान्यीकृत दरें |
| 2 राज्य | 34.74 |
| 3 राज्य | 153.40 |
| 4 राज्य | 16.49 |
| 5 राज्य | 143.70 |
| रेसकोर्स रोड | 9.30 |
तालिका 1. Mitochondrial श्वसन दर कंकाल mitochondria मांसपेशियों से Representativeoxygen खपत की दर. मान चैम्बर के लिए जोड़ा mitochondria की राशि के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) 3 4 राज्य द्वारा राज्य को विभाजित करके निर्धारित किया जाता है. एक रेसकोर्स रोड ≥ 4 एक व्यवहार्य mitochondria तैयारी का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
हम एक कंकाल की मांसपेशियों से व्यवहार्य mitochondria अलग प्रोटोकॉल वर्तमान. यदि उपज एक समस्या है, प्रोटोकॉल बर्फ में 30 मिनट के लिए PBS/10mM trypsin EDTA/0.01% के 5 मिलीलीटर में अलग मांसपेशी incubating द्वारा संशोधित किया जा सकता है. Trypsin के साथ पूरा मांसपेशी पाचन आश्वासन, मांसपेशियों को पूरी तरह से कीमा बनाया हुआ की जरूरत है. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, PBS/10mM EDTA/0.01% trypsin समाधान पूरी तरह से अलगाव एक बफर (IB1) के 3 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, trypsin का उपयोग श्वसन प्रोटोकॉल के दौरान कुछ mitochondrial substrates के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. सभी अच्छी mitochondrial तैयारियाँ जब trypsin का उपयोग में इस प्रोटोकॉल परिणाम में इस्तेमाल किया substrates.
माउस कंकाल की मांसपेशियों के लिए, यह सबसे अच्छा है करने के लिए दोनों पैरों से gastrocnemius मांसपेशियों गठबंधन है, या पूरे डायाफ्राम का उपयोग करें. चूहे कंकाल की मांसपेशियों के लिए, gastrocnemius या डायाफ्राम के एक छोटे अनुभाग के लिए पर्याप्त है. अत्यधिक मांसपेशियों कम पैदावार में अलगाव की प्रक्रिया और परिणाम जटिल हो सकता है. Extraocular मांसपेशियों के रूप में बहुत छोटे मांसपेशियों के अलगाव के लिए, यह अधिक से अधिक 1 पशु से पूल मांसपेशियों को आवश्यक मांसपेशियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
SN1 और SN2: इस प्रोटोकॉल दो अलग supernatants के लिए संदर्भित करता है. ये supernatants अंतर centrifugation के परिणाम हैं और गैर mitochondrial प्रोटीन होते हैं. इन supernatants से प्रोटीन और अंतिम mitochondrial गोली से पश्चिमी blots में mitochondrial तैयारी की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पश्चिमी blots का उपयोग कर mitochondrial और cytoplasmic एंटीबॉडी अंतिम गोली में अपने mitochondrial तैयारी की शुद्धता की पुष्टि करें.
Mitochondrial श्वसन उपकरण क्लीनिंग एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है. एक प्रयोग के बाद, कक्षों निम्नानुसार अच्छी तरह से साफ करना चाहिए: कक्षों आसुत जल के साथ पांच बार कुल्ला, 70% इथेनॉल के साथ एक बार कुल्ला इथेनॉल घुलनशील substrates को हटाने, पीबीएस / BSA के बारे में 5 मिनट के लिए एक संतृप्त समाधान के साथ कुल्ला, अंत में, कक्षों आसुत जल के साथ 5 बार कुल्ला. क्लार्क प्रकार इलेक्ट्रोड ठीक से आसुत जल के साथ कई बार rinsing और धीरे से एक टूथब्रश के साथ झाड़ी से प्रत्येक उपयोग के बाद साफ होना चाहिए. फिर, वे पूरी तरह व्रत - मुक्त पोंछे के साथ सूख जाना चाहिए और एक desiccator में संग्रहीत. एक बार एक हफ्ते, इलेक्ट्रोड Oxygraph चमकाने किट का उपयोग पॉलिश किया जाना चाहिए.
Mitochondrial substrates के शेयर समाधान के रूप में तैयार कर रहे हैं, aliquoted और -20 ओ सी पर संग्रहीत हम substrates के पुनः उपयोग की सिफारिश नहीं है. हमारे अनुभव में, substrates के अधिकांश -20 ओ सी पर स्थिर oligomycin है कि हर 2 महीने या तो प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए के लिए कई महीनों के लिए छोड़कर हैं ,. हमेशा अधिक जानकारी के लिए निर्माता विनिर्देशों के लिए उल्लेख.
अंत में, इस प्रोटोकॉल को भी दिल से mitochondria अलग इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य मांसपेशियों के लिए के रूप में जानवर के आकार (चूहा बनाम माउस) का निर्धारण करेगा अंग के किस अंश पर्याप्त mitochondria प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम एफएच Andrade राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EY12998 R01) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
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