Summary
이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다
Abstract
Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다.
여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P - [trifluoromethoxy]이 - 페닐 - hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.
요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.
Protocol
1. 버퍼의 준비
- 원심 분리기의 5804R 켜고 4로 설정 ° C. 37 ° C.에 Isotemp 3006D 물 욕조와 세트를 켭니다
- 근육 분리하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- PBS : 증류수 (5 정제 / 리터)의 인산 버퍼 호수 (PBS) 정제를 디졸브. 잘 섞는다.
- PBS 추가로 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 100 ML 솔루션을 준비하려면, PBS의 98 ML 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML를 추가합니다.
- 8X Mitochondria 버퍼 : 0.6의 최종 농도 M, 자유 지방산 400 MG에 대한 자당의 10.28 g 소 혈청 0.8 %의 최종 농도, 160 mm의 최종 농도에 대한 HEPES의 2.08 g, pH를위한 (BSA) 알부민 증류수로 50 ML에 7.4와 QS.
- 절연 버퍼 1 (IB1가) : 10-10 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl 추가 증류수와 ML.
- 절연 버퍼 2 (IB2가) 10-3 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM의 EGTA 60 μl 추가 증류수와 ML.
- 실험 버퍼 (EB)는 :의 최종 농도 5 mm의 최종 농도, 215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 0.392 g, 2.5 mm의 25 μl KH 2 PO 4 500 MM MgCl 2 100 μl 추가 6.25 μm의 20 μm의의 최종 농도 100 MM EGTA 2 μl, mitochondrial 버퍼, 산도 7.4과 QS 증류수 10 ML에의 1.25 ML.
2. 근육 절연
- 얼음 양동이에 세 10 ML의 비커, 포터 - Elvehjem 조직 그라인더와 얼음 악기 / 용품 기타 필요한 넣어. 모든 실험을하는 동안 얼음처럼 차가운 유지합니다.
- 완료 온수 욕조에 얼음 양동이와 EB에 IB1 및 IB2를 놓습니다.
- 세 10 ML 비커에 다음 솔루션은 추가한다 :
- 비커 1 PBS 10 ML
- 비커 2 : PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML
- 비커 3 : IB1 3 ML
- 편안하게 같은 지역 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인을 쥐를 죽여.
- 신속, 골격근의 250-500 밀리그램을 분리 비커 1 린스, 다음 비커 2 전송할 수 있습니다.
3. 균질 / Mitochondrial 절연
- 비커 3 근육을 전송하고 가늘게 가위로 근육을 말하다.
- 포터 - Elvehjem 균 질기에 대한 해결책을 전송합니다. 항상 얼음에 튜브를 유지 전동 유봉 (드릴 언론 작업을 다하겠습니다) 10 번 사용하여 근육을 균질.
- 4 10 분 700g ° C.에 사전 냉장 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 원심 분리기에 homogenate 전송
- 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는 전송합니다. 펠렛 폐기하십시오.
- 4 10 분 10,500그램에 뜨는 원심 분리기 ° C.
- 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN1 (뜨는 숫자 1)와 근육의 유형에 뜨는 전송합니다.
- IB2 500 μl의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 4 10 분 10,500그램에서 원심 분리기 ° C.
- 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN2 (뜨는 번호 2) 근육의 종류에 뜨는 전송합니다.
- IB2 100 μl의 최종 mitochondrial 펠렛을 일시 중지합니다.
- 몇 초 동안 minifuge에 다시 스핀 최종 mitochondrial 현탁액. 펠렛있다면, 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는를 전송하여 펠렛을 삭제.
- 브래드 포드 분석 8을 사용 단백질 농도를 결정합니다.
4. 전극 보정
참고 : mitochondrial 격리하는 동안 완벽한 전극 교정.
- 250 ML 플라스크에 증류수 100 ML을 추가합니다. 대기 가스와 물을 평형 20 분 동안 적극적으로 저어.
- Oxygraph 전극에 KCl 50 % 몇 방울을 추가합니다.
- 전극 위에 블루 Rizla 롤링 종이의 작은 조각을 넣으십시오.
- 롤링 종이 위에 PTFE 막 조각을 넣으십시오.
- 반지의 작은 주걱을 사용하여 내부 링을 적용한 다음 전극 홈에서 외륜을 놓으십시오.
- 전극을 연결하고 장비의 나머지 부분 조립 : 큰 플라스틱 링베이스, mitochondrial 회의소와 물 호스합니다.
- Oxygraph 박스의 전원을 켜고 Oxygraph 소프트웨어를 시작합니다.
- mitochondrial 챔버에 equilibrated 물을 추가합니다.
- 막대를 저어 60의 속도에 설정 추가합니다.
- 새로운 실험을 시작합니다.
- 교정을 클릭한 다음 상자 1 액상 보정. 37 온도를 변경하는 것은 ° C 및 "확인"을 두 번 누릅니다.
- "OK"를 "무시"변경을 클릭하고 질소 가스 탱크를 열 때.
- 연결된 플레이스 팁챔버에 질소 탱크와 제로 산소를 설정합니다. 그것이에서 스위치 때 "확인"을 클릭 "무시."
- 물을 기음과 mitochondrial 방으로 EB 버퍼 500 μl를 추가합니다.
- 플런저와 인감 챔버.
- 여러 개의 상자를 사용하여 반복 박스 2의 보정을위한 11-15 단계를하십시오.
5. Mitochondrial 호흡
- 새로운 실험을 시작, 그것이 신호를 안정화하기 위해 약 1 분간 실행하자.
- 150 각 챔버에 μg, 마크 이벤트 mitochondrial 정지 필요한 볼륨 (3.11 단계)을 추가하고 1 분 해보죠.
- 10 μl를 추가 따뜻한 250 mM/125 MM 5 mM/2.5 mm의 최종 농도에 대한 글루 탐 산염 / malate. 마크 1 분간 실행하자. 이 상태 2로 정의됩니다.
- 150 μm의, 마크의 최종 농도 10 MM의 ADP의 7.5 μl를 추가하고 30 초 동안 실행하자. 이것은 주 3으로 정의됩니다.
- 10 MM ADP, 마크의 또 다른 7.5 μl을 추가하고 1.5 분 동안 실행하자.
- 1 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 차가운 10 MM의 oligomycin 0.5 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 4로 정의됩니다.
- 0.2 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 추위 0.1 MM FCCP 1 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 5 말합니다.
- 완료되면 실험을 종료하고 저장합니다.
- Oxygraph 소프트웨어를 사용하여 호흡 속도를 취득.
- 정규화 계수를 입력하십시오 : mitochondrial 단백질 150 μg을 추가하는 경우 정규화 계수는 0.15 것입니다.
- 다른 호흡 상태에 대한 표준 호흡 속도를 계산합니다.
- 주 4로 주 3 나누어 호흡기 제어 비율 (RCR)를 계산합니다.
6. 대표 결과 :
그림 1. mitochondria 골격근의 산소 소비의 추적 대표를 보여줍니다. 전극 신호가 안정화되면 mitochondria 샘플 Oxygraph 챔버에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 조미료와 malate를 추가로 시작합니다. ADP의 또한 주 3 호흡을 정의, 산소 소비를 증가시킵니다. ATP synthase는 상태의 네 호흡을 얻기 위해 oligomycin의 추가에 의해 차단됩니다. 마지막으로, FCCP는 mitochondrial 호흡 (주 5) 떨어지다에 추가됩니다. 표 1 주에서 2, 3, 4 및 5에 대한 대표적인 산소 소비 속도를 보여줍니다. 호흡 조절 비율 (RCR)가 각 실험에 대해 계산됩니다. RCR은 ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.
미국 | 정규 요금 |
상태 2 | 34.74 |
주 3 | 153.40 |
주 4 | 16.49 |
주 5 | 143.70 |
RCR | 9.30 |
표 1. Mitochondrial 호흡 속도. mitochondria 골격근에서 Representativeoxygen 소비 속도. 값이 챔버에 추가 mitochondria의 크기로 정규화됩니다. 호흡 조절 비율 (RCR)는 주 4에 의해 상태가 3 나눔으로써 결정됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비를 나타냅니다.
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Discussion
우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신의 사용은 호흡 프로토콜 중 일부 mitochondrial 기판을 방해할 수 있습니다. 트립신을 사용하는 좋은 mitochondrial 준비에서이 프로토콜 결과에 사용된 모든 기판.
마우스 골격 근육 들어, 두 다리에서 gastrocnemius 근육을 결합하거나, 전체 다이어프램을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 쥐의 골격 근육 들어, gastrocnemius 또는 피임기구의 작은 부분 충분합니다. 과도한 근육 질량은 낮은 수율에 격리 과정 및 결과를 복잡하게하실 수 있습니다. 같은 extraocular 근육과 같은 아주 작은 근육의 고립을 위해, 그것은 필요한 근육 질량을 얻는 이상 한 동물에서 풀 근육이 필요합니다.
SN1과 SN2 :이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 supernatants를 말합니다. 이러한 supernatants은 차동 원심 분리의 결과가 아닌 mitochondrial 단백질이 포함되어 있습니다. 이러한 supernatants로부터 최종 mitochondrial 펠렛의 단백질은 mitochondrial 준비의 순도를 확인하기 위해 서양 blots에 사용할 수 있습니다. mitochondrial 및 세포질 항체를 사용하여 서양 blots은 최종 펠렛에 mitochondrial 준비의 순결을 확인합니다.
mitochondrial 호흡 장비를 청소하는 것은 성공적인 실험을위한 중요합니다. 각 실험 후, 실은 다음과 같이 철저하게 세척해야합니다 증류수와 챔버 다섯 번 린스, 결국, 약 5 분 동안 PBS / BSA의 포화 용액과 함께 린스, 에탄올 가용성 기판을 제거하는 70 % 에탄올로 한 번 헹굼 증류수와 챔버, 5 번 씻어. 클라크 형 전극 제대로 증류수로 여러 번 rinsing과 칫솔로 부드럽게 청소하여 모든 사용 후 세척해야합니다. 그렇다면, 그들은 완전히 대여 - 무료 잎사귀와 건조 및 건조기에 저장해야합니다. 일주일에 한 번 전극은 Oxygraph 연마 키트를 사용하여 연마해야합니다.
Mitochondrial 기판은 -20 O C.에서 주식 솔루션으로 준비 aliquoted 및 저장됩니다 우리는 기판을 다시 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서는, 기판의 대부분은 매 2 개월 있으므로 교체해야합니다 oligomycin를 제외하고, 몇 개월 -20 O C에서 안정하고 있습니다. 항상 자세한 내용은 제조 업체의 사양을 참조하십시오.
마지막으로,이 프로토콜은 또한 마음에서 mitochondria 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 근육에 관해서는, 동물의 크기 (대 쥐 마우스)은 장기 어떤 분율 것은 충분한 mitochondria를 얻을 필요가 결정됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
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