Summary
Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van Scorrano
Abstract
Mitochondriën zijn organellen beheersen het leven en de dood van de cel. Ze nemen deel aan de belangrijkste metabolische reacties, synthetiseren het grootste deel van de ATP, en regelen een aantal signaaltransductiecascades 2,3. Vroegere en huidige onderzoekers hebben geïsoleerd mitochondriën van ratten en muizen weefsels, zoals lever, hersenen en hart 4,5. In de afgelopen jaren, hebben veel onderzoekers zich op het bestuderen van de mitochondriale functie van de skeletspieren.
Hier beschrijven we een methode die wij met succes hebben gebruikt voor de isolatie van de mitochondriën van skeletspieren 6. Onze procedure schrijft voor dat alle buffers en reagentia zijn vers gemaakt en moet ongeveer 250-500 mg van de skeletspieren. We bestudeerden mitochondria geïsoleerd van rat en muis gastrocnemius en diafragma, en de rat extraoculaire spieren. Mitochondriale eiwit concentratie wordt gemeten met de Bradford assay. Het is belangrijk dat mitochondriale monsters worden bewaard ijskoud tijdens de voorbereiding en dat de functionele studies worden uitgevoerd binnen een relatief korte tijd (~ 1 uur). Mitochondriale ademhaling wordt gemeten met behulp van polarografie met een Clark-type elektrode (Oxygraph systeem) bij 37 ° C 7. Ijking van de zuurstof elektrode is een belangrijke stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd. Geïsoleerde mitochondria (150 ug) worden toegevoegd aan 0,5 ml van de experimentele buffer (EB). Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat (5mm) en malaat (2,5 mm). Vervolgens wordt adenosine difosfaat (ADP) (150 uM) toegevoegd aan de staat 3 te starten. Oligomycin (1 uM), een ATPase synthase blocker, wordt gebruikt om de toestand 4 schatten. Ten slotte carbonyl cyanide p-[trifluormethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wordt toegevoegd aan 5 measurestate, of afgekoppeld ademhaling 6. De respiratoire controle ratio (RCR), de verhouding van toestand 3 naar toestand 4, wordt berekend na elk experiment. Een RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding.
Kortom, presenteren we een methode voor de isolatie van levensvatbare mitochondria van de skeletspieren die kunnen worden gebruikt in de biochemische (bijvoorbeeld enzymactiviteit, immunodetectie, proteomics) en functionele studies (mitochondriale ademhaling).
Protocol
1. Voorbereiding van de Buffers
- Zet de centrifuge 5804R en ingesteld op 4 ° C. Zet Isotemp 3006D waterbad en ingesteld op 37 ° C.
- Bereid de volgende oplossingen voor spier isolatie:
- PBS: Los fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten in gedestilleerd water (5 tabletten / liter). Meng goed.
- PBS plus 10 mM EDTA: te bereiden een 100 ml oplossing, 2 ml van 500 mM EDTA toe te voegen aan 98 ml PBS.
- 8X Mitochondriën buffer: 10,28 g sucrose voor een uiteindelijke concentratie van 0,6 M, 400 mg van free-vetzuur bovine serum albumine (BSA) voor een uiteindelijke concentratie van 0,8%, 2,08 g HEPES voor een uiteindelijke concentratie van 160 mM, pH naar 7,4 en QS op 50 ml met gedestilleerd water.
- Isolatie Buffer 1 (IB1): Voeg 200 ui van 500 mM EDTA voor een uiteindelijke concentratie van 10 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 1,25 ml van 8X mitochondria buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water.
- Isolatie Buffer 2 (IB2): Voeg 60 pi 500 mM EGTA voor een uiteindelijke concentratie van 3 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 1,25 ml van 8X mitochondria buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water.
- Experimentele Buffer (EB): Voeg 100 ul van 500 mM MgCl 2 voor een uiteindelijke concentratie van 5 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 25 pl van 2,5 mM KH 2 PO 4 voor een uiteindelijke concentratie van 6,25 uM, 2 pi van 100 mM EGTA voor een uiteindelijke concentratie van 20 uM, 1,25 ml van mitochondriale buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water.
2. Muscle Isolatie
- In een ijsemmer, zet drie 10 ml bekers, Potter-Elvehjem weefsel slijpmachines en alle andere benodigde instrumenten / supplies op ijs. Alles moet ijskoud blijven gedurende het experiment.
- Plaats IB1 en IB2 in ijsemmer en EB in warm water bad als u klaar bent.
- In de drie 10 ml bekers, moeten de volgende oplossingen toegevoegd:
- Beker 1: 10 ml PBS
- Beker 2: 10 ml PBS / EDTA
- Beker 3: 3 ml IB1
- Dood een rat humane manier, zoals goedgekeurd door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite.
- Snel isoleren 250-500 mg van de skeletspieren, spoelen in een beker, vervolgens transfer naar Beaker 2.
3. Homogenisering / Mitochondriale Isolation
- Overdracht spier Beaker 3 en fijn de spier gehakt met een schaar.
- Breng de oplossing aan de Potter-Elvehjem homogenisator. Homogeniseren van de spier met behulp van een gemotoriseerd stamper (een kolomboormachine zal het werk te doen) die 10 maal het bijhouden van de buis in het ijs te allen tijde.
- Overdracht homogenaat vooraf gekoelde 2 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 700 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis. Gooi pellet.
- Centrifugeer supernatant bij 10.500 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en label SN1 (supernatant nummer 1) en spieren type.
- Re-schorten pellet in 500 ui IB2.
- Centrifugeer bij 10.500 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en label SN2 (supernatant nummer 2) en spieren type.
- Schorten laatste mitochondriale pellet in 100 ui IB2.
- Re-spin finale mitochondriale suspensie in minifuge voor een paar seconden. Als er een pellet, transfer supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en gooi de pellet.
- Bepaal eiwitconcentratie het gebruik van de Bradford assay 8.
4. Electrode Kalibratie
LET OP: Complete elektrode kalibratie tijdens het mitochondriale isolatie.
- Voeg 100 ml gedestilleerd water tot 250 ml kolf. Roer krachtig gedurende 20 minuten aan het water met atmosferische gas evenwicht.
- Voeg een paar druppels van 50% KCl aan de Oxygraph elektrode.
- Leg een klein stukje van Blue Rizla vloei op de top van de elektrode.
- Leg een stuk van PTFE membraan op de top van de vloei.
- Breng de binnenring met behulp van de ring applicator en dan de buitenste ring plaats in de elektrode groef.
- Sluit de elektroden en de montage van de rest van de apparatuur: grote plastic ring basis, mitochondriale kamer, en waterslangen.
- Zet Oxygraph dozen en start Oxygraph software.
- Voeg het water evenwicht tot mitochondriale kamer.
- Voeg roer bar en op een snelheid van 60 beurt.
- Begin een nieuw experiment.
- Klik op kalibreren en vervolgens vloeibare fase kalibratie voor Box 1. Verandering temperatuur tot 37 ° C en klik op "OK" twee keer.
- Wanneer "Override" verandert in "OK" klik hierop en open de stikstof gas tank.
- Plaats tip verbonden met stikstof tank in de kamer en stellen nul zuurstof. Clikken "OK" voor het omschakelen van "Override".
- Aspireren water en voeg 500 ul van EB buffer tot mitochondriale kamers.
- Afdichtingskamer met zuiger.
- Bij gebruik van meerdere dozen, herhaalt u de stappen 11-15 voor de kalibratie van Box 2.
5. Mitochondriale ademhaling
- Start een nieuw experiment, laat het uit te voeren gedurende ongeveer 1 minuut om het signaal te stabiliseren.
- Voeg noodzakelijke volume van de mitochondriale suspensie (stap 3,11) voor 150 mg in elke kamer, Mark evenement, en laat het uit te voeren gedurende 1 minuut.
- Voeg 10 ul van warm 250 mM/125 mM glutamaat / malaat voor een uiteindelijke concentratie van 5 mM mM/2.5. Mark en laten lopen gedurende 1 minuut. Dit wordt gedefinieerd als twee staat.
- Voeg 7,5 pi van 10 mM ADP voor een uiteindelijke concentratie van 150 uM, merk, en laat draaien voor 30 seconden. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 3.
- Voeg nog een 7,5 pl van 10 mM ADP, merk, en laat draaien 1,5 minuten.
- Voeg 0,5 pi van koude 10 mM oligomycin voor een uiteindelijke concentratie van 1 uM, merk, en laat lopen gedurende 3 minuten. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 4.
- Voeg 1 ui van koude 0,1 mM FCCP voor een uiteindelijke concentratie van 0,2 uM, merk, en laat lopen gedurende 3 minuten. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 5.
- Wanneer u klaar bent, eind experiment en op te slaan.
- Verwerven ademhaling met behulp van Oxygraph software.
- Vul normalisatie factor: als het toevoegen van 150 ug van mitochondriale eiwit, de normalisatie factor wordt 0.15.
- Bereken genormaliseerd ademhaling tarieven voor de verschillende toestanden ademhaling.
- Bereken de Respiratory Controle Ratio (RCR) wordt berekend door Staat drie door de staat 4.
6. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Toont een vertegenwoordiger opsporen van zuurstofverbruik door skeletspieren mitochondriën. Nadat de elektrode signaal is gestabiliseerd, is de mitochondriën monster toegevoegd aan de Oxygraph kamer. Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat en malaat. Toevoeging van ADP verhoogt de zuurstof consumptie, het definiëren van de staat 3 ademhaling. ATP synthase wordt geblokkeerd door de toevoeging van oligomycin naar toestand 4 ademhaling te verkrijgen. Tot slot wordt FCCP toegevoegd aan mitochondriale ademhaling (staat 5) los te koppelen. Tabel 1 geeft representatieve zuurstofverbruik voor staten 2, 3, 4 en 5. De respiratoire controle ratio (RCR) wordt berekend voor elk experiment. RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding.
| Staten | Genormaliseerd Tarieven |
| Toestand 2 | 34,74 |
| Staat 3 | 153,40 |
| Toestand 4 | 16,49 |
| Toestand 5 | 143,70 |
| RCR | 9.30 |
Tabel 1. Mitochondriale ademhaling. Representativeoxygen consumptie prijzen van skeletspieren mitochondriën. De waarden zijn genormaliseerd om de hoeveelheid van de mitochondriën toegevoegd aan de kamer. De respiratoire controle ratio (RCR) wordt bepaald door de staat drie door de staat 4. Een RCR ≥ 4 vertegenwoordigt een levensvatbare mitochondria voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol om levensvatbare mitochondria isoleren van skeletspieren. Wanneer de opbrengst een probleem is, kan het protocol worden gewijzigd door het incuberen van de geïsoleerde spier in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine gedurende 30 minuten in het ijs. Te garanderen een volledige spier spijsvertering met trypsine, de spier volledig moet worden gehakt. Nadat de 30-minuten incubatie, moet de PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine-oplossing volledig worden vervangen door 3 ml van isolatie buffer 1 (IB1). Daarnaast kan het gebruik van trypsine interfereren met sommige mitochondriale substraten tijdens de ademhaling protocol. Alle substraten gebruikt in dit protocol resulteren in een goede voorbereiding bij het gebruik van mitochondriale trypsine.
Voor muis skeletspieren, is het het beste om de gastrocnemius spieren van beide benen te combineren, of het hele membraan te gebruiken. Voor de rat skeletspieren, een klein deel van gastrocnemius of pessarium is voldoende. Overmatig spiermassa kan compliceren de isolatie procedure en resulteren in lagere opbrengsten. Voor het isoleren van zeer kleine spieren, zoals de extraoculaire spieren, is het nodig om de spieren pool van meer dan een dier te verkrijgen van de nodige spiermassa.
Dit protocol heeft betrekking op twee verschillende supernatants: SN1 en SN2. Deze supernatants zijn het resultaat van differentiële centrifugatie en bevatten niet-mitochondriale eiwitten. Eiwitten uit deze supernatanten en van het laatste mitochondriale pellet kan gebruikt worden in het westen van blots aan de zuiverheid van de mitochondriale voorbereiding te controleren. Western blots met behulp van mitochondriale en cytoplasmatische antistoffen bevestigt de zuiverheid van uw mitochondriale voorbereiding in de laatste pellet.
Het reinigen van de mitochondriale ademhaling apparatuur is van cruciaal belang voor een succesvol experiment. Na elk experiment moet de kamers grondig worden gereinigd als volgt: spoelen kamers vijf keer met gedestilleerd water, een keer spoelen met 70% ethanol ethanol oplosbare substraten te verwijderen, spoelen met een verzadigde oplossing van PBS / BSA voor ongeveer 5 minuten, tot slot, Spoel kamers 5 keer met gedestilleerd water. Clark-type elektroden moeten goed worden gereinigd na elk gebruik spoelen verschillende keren met gedestilleerd water en zacht geschrobd met een tandenborstel. Dan moeten ze volledig worden gedroogd met geleend zonder doekjes en opgeslagen in een exsiccator. Eenmaal per week, moet de elektroden worden gepolijst met behulp van de Oxygraph polijsten kit.
Mitochondriale substraten zijn bereid als stockoplossingen, gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 ° C. We raden niet aan het hergebruik van substraten. In onze ervaring, de meeste van de substraten zijn stabiel bij -20 o C gedurende enkele maanden, behalve voor oligomycin dat moet worden vervangen om de 2 maanden of zo. Raadpleeg altijd de specificaties van de fabrikant voor meer informatie.
Ten slotte kan dit protocol ook gebruikt worden om te isoleren mitochondria van het hart. Zoals voor andere spieren, zal de grootte van het dier (rat vs muis) te bepalen welk deel van het orgel is noodzakelijk om voldoende mitochondriën te krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Eye Institute (R01 EY12998) naar FH Andrade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
