Summary
هذا الفيديو يظهر تقنية فعالة للتمييز وتشريح مختلف هياكل شبه شفافة من الجسم الزجاجي في العين البشرية بعد الوفاة.
Abstract
والزجاجي هو ، كولاجيني واضحة بصريا المصفوفة خارج الخلية التي تملأ داخل العين ويعتلي الشبكية. الشاذ 1،2 التفاعلات بين الأساسات الزجاجي والشبكية وراء أمراض الشبكية عدة ، بما في ذلك المسيل للدموع وانفصال الشبكية ، تجعد البقعة الصفراء ، الثقب البقعي ، سن المتصلة تحلل البقعة الصفراء vitreomacular الجر ، vitreoretinopathy التكاثري ، اعتلال الشبكية السكري التكاثري ، وvitreoretinopathies الموروثة ، 1،2 ولا يعرف التركيب الجزيئي للالأساسات الزجاجي. لأن الجسم الزجاجي شفافا مع وصول جراحية محدودة ، فقد كان من الصعب دراسة الأساسات على المستوى الجزيئي. طورنا طريقة لفصل والحفاظ على هذه الأنسجة للتحليل البروتين والبيوكيميائية. تقنية التشريح في هذا الفيديو التجريبية تبين كيفية عزل القاعدة الزجاجية ، الزجاجية الأمامية ، الزجاجي الأساسية ، والقشرة الزجاجية من عيني بعد الوفاة الإنسان. وأظهر أحد الأبعاد SDS - PAGE تحليل كل عنصر زجاجي أن أسلوبنا تشريح أدى في أربعة ملامح البروتين فريد المقابلة لكل طيدة من الجسم الزجاجي الإنسان. سوف تحديد البروتينات مجزأة تفاضليا تكشف مرشح جزيئات الأمراض الكامنة الشبكية المختلفة.
Protocol
1. الجزء الأمامي للتشريح.
- يتم إزالة القرنية عن طريق شق أولا في حوف في الغرفة الأمامية باستخدام شفرة 15 درجة (الشكل 1). ثم يتم إدخال شفرة واحدة من مقص القرنية الصلبة ، منحنية في الغرفة الأمامية. يتم إجراء تخفيضات كفافي في القرنية ، الأمامي فقط لحوف.
- وتستخدم 0.12 COLIBRI ملقط ومقص يستكوت لقطع القزحية الأمامي circumferentially إلى الجسم الهدبي.
- يتم إزالة نواة العدسة مع ملقط COLIBRI 0.12 أو 15 درجة شفرة (supersharp) والقشرة وكبسولة بالملقط.
2. الزجاجي الأساسية الطموح.
- يتم إدخال إبرة عيار 23 على حقنة 5 سم مكعب في منتصف الزجاجي (الشكل 1).
- ويستنشق حوالي بلطف 1 مل أو أكثر من جوهر الزجاجي.
- ثم يتم وضع العينة في أنبوب microfuge ثم في النيتروجين السائل.
3. تشريح الجسم الزجاجي الأمامي.
- وينظر في الجسم الزجاجي الأمامي وحلقة شبه شفافة من خلال تعديل على ضوء الحادث من مجهر الضوء أوزة الرقبة. الطموح السابقة من صميم زجاجي يفصل بين الجسم الزجاجي الأمامي من الهياكل الأخرى لتسهيل عملية تحديد الهوية.
- يتم سحبها بعناية ورقة من الأنسجة المرنة بعيدا عن الجسم الهدبي مع COLIBRI أو ملقط خلع الملابس وقطع مع مقص Vannas. يتم تكرار هذه المناورة.
- ثم يتم وضع العينة في أنبوب microfuge ثم في النيتروجين السائل.
4. الزجاجي قاعدة تشريح.
- باستخدام الملقط 0.12 لتحقيق الاستقرار في كوب العين ، ويتم استخدام مقص يستكوت الى "زهرة" للعين عن طريق صنع اربع فترات متساوية تخفيف الإجهاد تخفيضات من الجسم الهدبي نحو الرأس العصب البصري.
- تتم إزالة الجزء ذو ثنيات الجسم الهدبي (الشكل 2) من كل من الأرباع باستخدام مقص يستكوت.
- ثم يتم اغتنامها قاعدة الزجاجي على جانبي مشرشر ORA مع ملقط على مسطح بارس وشبكية العين (الشكل 2).
- يتم تطبيق الجر المستمر على قاعدة الزجاجي مع ملقط. قطع متسلسلة مع مقص يستكوت مقتطفات نسيج شبه شفافة مع ظهور "سلسلة من اللؤلؤ" كما هو مفروض ضريبة عليه.
- ثم يتم وضع العينة في أنبوب microfuge ثم في النيتروجين السائل.
5. الزجاجي إزالة القشرة.
- يستأصل فيه مسطح الجزء من كل من الأرباع مع مقص يستكوت بقطع النشرة حوالي 3 ملم الخلفي للمشرشر أورا (الشكل 2).
- بين منشورات الأنسجة ، والقشرة الزجاجية كما هو تصور فيلم شبه شفافة.
- هو أدرك أن الفيلم إما مرونة مع 0.12 ملقط أو تحتجزهم التمسك اسفنجة ويك - سيل الجراحية. ثم يتم سحبها القشرة الزجاجية بعيدا عن شبكية العين ورفعه مع مقص يستكوت (الشكل 1).
- يتم وضع العينة في أنبوب microfuge ثم إلى النيتروجين السائل. يتم تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية لحين الاستفادة منها للتجريب.
6. ممثل النتائج
يمكن معالجة عينات الأنسجة من جانب مجموعة متنوعة من الأساليب لتجارب معينة. في حالتنا ، وقدمت عينات للتحليل البروتين بواسطة SDS - PAGE (الشكل 3).
الشكل 1. مستعرضة رأي العين البشرية تصور الأساسات مختلفة من الجسم الزجاجي ، ومعظم الزجاجي الأمامي هو طبقة رقيقة تسمى كولاجيني الزجاجية الأمامية. جوهر الزجاجي تشمل المنطقة بأسرها المركزية من الجسم الزجاجي. هذا الجزء من الجسم الزجاجي هو أكثر مائي على النقيض من قاعدة الزجاجي ، وهو ما يكفي للزج يجب اغتنامها بواسطة ملقط ويرد بحزم على الجسم الهدبي الكامنة وشبكية العين. تشمل جوهر الزجاجي هو قشرة رقيقة جدا كولاجيني يسمى القشرة الزجاجية.
الشكل 2. تشريح الجسم الزجاجي قاعدة ، وقاعدة الزجاجي هو طيدة شبه شفافة من الجسم الزجاجي الموجود على طول مشرشر أورا (السهام البيضاء) ، والذي هو خط فاصل يفصل بين الجسم الهدبي والشبكية. الحدود الأمامية للقاعدة زجاجي مسطح تمتد على الجزء (الخط الأبيض) من الجسم الهدبي. الحدود الخلفي من قاعدة زجاجي يمتد 2-3 ملم الخلفي للمشرشر أورا (اندفاعة بيضاء). لاستئصال القاعدة الزجاجية ، وتستخدم لفهم ملقط الأنسجة وتسحبه بعيدا عن الجسم الهدبي وراء شبكية العين. وتستخدم مرة واحدة مرتفعة ، مقص لقطع يستكوت على طول القاعدة.
الشكل 3. أحادية البعد SDS - PAGE من عناصر الجسم الزجاجي. تركيزات البروتين الكلي للالزجاجية الأمامية ، وقاعدة زجاجي ، فيتامينوreous الأساسية ، والقشرة الزجاجية 11.24 ، 20.1 ، 16.61 ، 14.24 ملغ / مل ، على التوالي. تم تنفيذ الكهربائي للهلام في 200 كيلو فولت لمدة 45 دقيقة ، ملون مع فلامينغو (بيو راد) ، وتصور باستخدام التصوير VersaDoc النظام (بيو راد). لمحات عن الأنسجة المختلفة تظهر عصابات مماثلة عدة ، مما يدل إما الحفظ أو عبر تلويث البروتينات ، فضلا عن العصابات فريد (النجمة) ، مشيرا الى البروتينات المترجمة تفاضليا.
Discussion
الجسم الزجاجي هو مادة هلامية شبه شفافة الجزيئية التي يتم تكوينها غير مفهومة ، لا سيما على مستوى الأساسات وهي : قاعدة الزجاجي ، الأساسية ، والقشرة ، والزجاجية الأمامية. جوهر زجاجي يحتوي collagens الثاني والخامس والتاسع ، والحادي عشر ، جنبا إلى جنب مع البروتيوغليكان كبريتات شوندروتن ، والبروتيوغليكان كبريتات heparan وhyaluronan. بروتين 1،2 المؤشرات الحيوية الأساسية في الجسم الزجاجي ارتبطت بأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري. 3-5 كيف يتم التعبير عن هذه البروتينات بشكل مختلف في كل من الأساسات ، وفي كثير من الحالات لا يعرف هويات بروتين معين. قد تعطي هذه التفاصيل البصيرة إلى الأصل من البروتينات المرتبطة بالأمراض الشبكية محددة ومساعدة في المستقبل العلاجات المستهدفة. على الرغم من أنه لم يكن الفاصل الزمني الأمثل لتشريح الجثة بعد الوفاة تحديد الأنسجة ، قد تدهور البروتين يؤثر على التجارب المصب. على سبيل المثال ، يتأثر المناعية في العيون بعد الوفاة لمدة 12 ساعة ويمكن تخفيض بعض الأنشطة انزيم معين في غضون ساعات قليلة (المراقبة غير منشورة). وقد جمعت جميع الأنسجة في هذه الدراسة ما بين 2 و 8 ساعات من وفاة دون تغييرات كبيرة في التعبير عن البروتين أو صلاحيتها للanalsyis البروتيوميات. يتم اختيار تجميد النيتروجين السائل أكثر من طريقة لتثبيت الحفظ من أجل منع إجراء تغييرات صغيرة في بنية البروتينات التي تسببها عبر ربط تثبيتي ، والذي تجلى في الأنسجة الأخرى التي LC-MS/MS. 6 والدراسات البروتين تعتمد على القدرة على الدقة تشريح المقصورات مختلفة من الجسم الزجاجي ، كما تجلى في هذه التجربة الفيديو. لقد قمنا التحقق باستخدام تقنية تشريح 1 الابعاد SDS - PAGE. كما تشير نتائجنا ، وهناك وأعرب تفاضلي البروتينات في الجسم الزجاجي الأساسات المختلفة. وسوف تحدد هذه البروتينات توفير فهم أكثر تفصيلا من التقسيم الزجاجي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقدم التمويل من جانب النضال من أجل البصر. تم الحصول على أنسجة العين من ولاية ايوا البنك الليونز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
