Summary
Deze video toont een effectieve techniek voor het differentiëren en het ontleden van de verschillende semi-transparante structuren van het menselijk glasachtig lichaam in post mortem ogen.
Abstract
Het glasvocht is een optisch helder, collagene extracellulaire matrix dat de binnenkant van het oog en ligt over het netvlies vult. 1,2 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies onderbouw ten grondslag liggen aan verschillende vitreoretinale ziekten, waaronder retinale scheur en onthechting, macula pucker, maculair gaatje, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, vitreomaculaire tractie, proliferatieve vitreoretinopathie, proliferatieve diabetische retinopathie, en erfelijke vitreoretinopathies. 1,2 De moleculaire samenstelling van het glasvocht substructuren is niet bekend. Sinds het glasachtig lichaam is transparant met beperkte chirurgische toegang, is het moeilijk om haar substructuren studeren op moleculair niveau. We hebben een methode ontwikkeld om te scheiden en deze weefsels te bewaren voor proteomische en biochemische analyse. De dissectie techniek in deze experimentele video laat zien hoe te isoleren glasvocht basis, anterior hyaloid, glasachtige kern, en het glasvocht cortex van postmortale menselijke ogen. Eendimensionale SDS-PAGE analyses van elk onderdeel glasvocht toonde aan dat onze dissectie techniek resulteerde in vier unieke eiwitprofielen overeenkomt met elk onderbouw van het menselijk glasachtig lichaam. Identificatie van differentieel gecompartimenteerde eiwitten zal onthullen kandidaat-moleculen ten grondslag liggen aan de verschillende vitreoretinale ziekten.
Protocol
1. Anterieure Segment Dissection.
- Het hoornvlies wordt verwijderd door eerst een incisie aan de limbus in de voorste kamer met behulp van een 15 ° mes (figuur 1). En een blad van de gebogen hoornvlies-sclerale schaar wordt geplaatst in de voorste kamer. Omtrek sneden worden gemaakt in het hoornvlies, maar juist voor de limbus.
- 0.12 Colibri tang en schaar Westcott worden gebruikt om de iris omtrek anterior aan de ciliaire lichaam te snijden.
- De lens kern wordt verwijderd met 0,12 Colibri pincet of een 15 ° mes (supersharp) en de cortex en de capsule met een pincet.
2. Glasvocht Core aspiratie.
- Een 23-gauge naald op een 5-cc spuit is ingevoegd in het midden van glasvocht (figuur 1).
- Ongeveer 1 ml of meer van glasvocht kern is voorzichtig opgezogen.
- Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof.
3. Anterieure Hyaloid Dissection.
- De voorste hyaloid wordt gezien als een semi-transparante ring door het aanpassen van het invallende licht van een zwanenhals microscoop licht. Vorige aspiratie van het glasvocht kern scheidt de voorste hyaloid van andere structuren snellere identificatie.
- Het blad van de elastische weefsel wordt zorgvuldig getrokken uit de buurt van de ciliaire lichaam met Colibri of dressing pincet en snijden met Vannas schaar. Deze manoeuvre wordt herhaald.
- Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof.
4. Glasvocht Base Dissection.
- Met behulp van 0,12 tang voor het oog cup te stabiliseren, worden Westcott schaar gebruikt om "bloem" in het oog door het maken van vier gelijke afstand van elkaar om stress te verlichten snijdt van de ciliaire lichaam naar de oogzenuw hoofd.
- De pars plicata van het corpus ciliare (figuur 2) wordt verwijderd uit elk van de kwadranten met behulp van Westcott schaar.
- Het glasvocht basis wordt dan begrepen aan beide kanten van de ora serrata met een tang over de pars plana en het netvlies (zie figuur 2).
- Continue tractie op het glasvocht basis is aangebracht met de tang. Sequentiële snijden met een schaar Westcott extracten een semi-transparant weefsel met een 'parelketting' verschijning als het is weggesneden.
- Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof.
5. Glasvocht Cortex verwijderen.
- De pars plana is uitgesneden uit elk van de kwadranten met Westcott schaar door het snijden van de folder van ongeveer 3 mm achter de ora serrata (figuur 2).
- Tussen het weefsel folders, het glasvocht cortex wordt gevisualiseerd als een semi-transparante film.
- De elastische film is ofwel begrepen met 0,12 tang of gehouden door het volgen van een Weck-Cel chirurgische spons. Het glasvocht cortex wordt dan uit de buurt van het netvlies getrokken en weggesneden met Westcott schaar (Figuur 1).
- Het monster wordt geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof. Alle monsters worden bewaard bij -80 ° C tot gebruikt voor experimenten.
6. Representatieve resultaten
Weefsel monsters kan worden verwerkt door een verscheidenheid van methoden voor specifieke experimenten. In ons geval werden monsters voor eiwit analyse door SDS-PAGE (figuur 3).
Figuur 1. Dwarsdoorsnede van het menselijk oog beeltenis van verschillende substructuren van het glasachtig lichaam. De meest voorste glasvocht is een dun laagje collagene genaamd de voorste hyaloid. Het glasvocht kern bestaat uit de gehele centrale regio van het glasachtig lichaam. Dit gedeelte van het glasvocht wordt meer water in tegenstelling tot het glasvocht basis, die is viskeus genoeg om te worden gegrepen door de forceps en is stevig aan de onderliggende corpus ciliare en netvlies. Omvat het glasvocht kern is een zeer dunne collagene shell genoemd het glasvocht cortex.
Figuur 2. Glasvocht basis anatomie. Het glasvocht basis is een semi-transparante onderbouw van het glasachtig lichaam ligt langs de ora serrata (witte pijlen), dat is de scheidslijn het scheiden van de corpus ciliare en het netvlies. De voorste rand van het glasvocht voet strekt zich uit over de pars plana (witte lijn) van het corpus ciliare. De achterste rand van het glasvocht base verlengt 2-3-mm achter de ora serrata (wit streepje). Aan accijnzen het glasvocht basis, worden tang gebruikt om het weefsel te pakken en weg te trekken van de onderliggende corpus ciliare en netvlies. Eenmaal verheven, Westcott schaar worden gebruikt voor het snijden langs de basis.
Figuur 3. Eendimensionale SDS-PAGE van glasvocht Elements. Total eiwit concentraties voor de voorste hyaloid, glasvocht basis, vitreous kern, en het glasvocht cortex waren 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml, respectievelijk. Gelelektroforese werd uitgevoerd bij 200 kV gedurende 45 minuten, gekleurd met Flamingo (Bio-Rad), en gevisualiseerd met behulp van een VersaDoc Imaging systeem (Bio-Rad). De profielen voor de verschillende weefsels vertonen verschillende gelijkaardige bands, waarin zij hetzij geconserveerd of cross-verontreinigende eiwitten, alsmede de unieke bands (asterisk), wat aangeeft differentieel gelokaliseerde eiwitten.
Discussion
Het glasachtig lichaam is een semi-transparante gel die de moleculaire samenstelling is slecht begrepen, vooral op het niveau van de onderbouw: het glasvocht basis, kern, cortex, en de voorste hyaloid. Het glasvocht kern bevat collageen II, V, IX, en XI, samen met chondroïtine sulfaat proteoglycanen, heparansulfaat proteoglycanen, en hyaluronan. 1,2 Eiwit biomarkers in het glasvocht kern zijn in verband gebracht met ziekten zoals diabetische retinopathie. 3-5 Hoe Deze eiwitten zijn differentieel tot expressie in elk van de substructuren, en in veel gevallen de specifieke eiwit identiteiten, zijn niet bekend. Deze gegevens kunnen inzicht geven in de herkomst van de eiwitten die in verband met specifieke vitreoretinale ziekten en helpen doelwit toekomstige therapieën. Hoewel de optimale post mortem interval voor weefsel dissectie is nog niet vastgesteld, kunnen afbraak van eiwitten beïnvloeden stroomafwaarts experimenten. Zo is bijvoorbeeld immunohistochemie beïnvloed in 12-uur postmortem ogen en een aantal specifiek enzym activiteiten kunnen worden teruggebracht binnen een paar uur (niet gepubliceerd observatie). Alle weefsels in deze studie werden verzameld tussen 2 en 8 uur van de dood, zonder significante veranderingen in eiwitexpressie of geschiktheid voor proteomics analsyis. De vloeibare stikstof bevriezen methode van conservering is verkozen boven fixatie om kleine veranderingen in de eiwitstructuur veroorzaakt door fixatief verknoping, die is in andere weefsels aangetoond door LC-MS/MS te voorkomen. 6 Proteoom studies zullen afhangen van het vermogen om nauwkeurig ontleden de verschillende compartimenten van het glasvocht, zoals aangetoond in deze video experiment. We hebben gekeken naar de dissectie techniek met behulp van een-dimensionale SDS-PAGE. Als onze resultaten suggereren, zijn er differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in de verschillende substructuren glasachtig lichaam. Het identificeren van deze eiwitten zal een meer gedetailleerde kennis van glasvocht verkokering.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door Fight for Sight. Weefsels werden verkregen van de Iowa Lions Eye Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J.
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
