Summary
Nous décrivons une méthode pour préparer organotypiques coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Tranches de cerveau sont fixées sur les membranes poreuses et milieux de culture est autorisée à former une interface. Cette méthode préserve l'architecture brute de l'hippocampe pour 2 semaines de culture.
Abstract
L'hippocampe, une composante du système limbique, joue un rôle important dans la mémoire à long terme et de la navigation spatiale 1. Neurones de l'hippocampe peut modifier la force de leurs connexions, après de brèves périodes de forte activation. Ce phénomène, connu sous le nom de potentialisation à long terme (LTP) peuvent durer des heures ou des jours et est devenu le mécanisme de meilleur candidat pour l'apprentissage et la mémoire 2. De plus, l'anatomie bien définis et la connectivité de l'hippocampe 3 a fait un système modèle classique pour étudier la transmission synaptique et la plasticité synaptique 4.
Comme notre compréhension de la physiologie des synapses hippocampiques a grandi et est devenu acteurs moléculaires identifiés, un besoin de manipuler des protéines synaptiques est devenu impératif. Organotypiques cultures hippocampiques offrent la possibilité de manipulation génétique simple et précise intervention pharmacologique, mais maintenir l'organisation synaptique qui est essentiel pour comprendre le fonctionnement des synapses dans un contexte plus naturaliste que la routine des méthodes de culture neurones dissociés.
Nous présentons ici une méthode pour préparer et la culture des coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Cette méthode permet un accès facile à des tranches de manipulation génétique en utilisant des approches différentes comme une infection virale ou biolistique 5,6 7. En outre, les tranches peuvent être facilement récupérées pour des analyses biochimiques 8, ou transférés à des microscopes pour l'imagerie 9 ou 10 expériences électrophysiologiques.
Protocol
1. Avant de commencer la préparation des coupes d'hippocampe.
- Préparer la trancheuse tissus en plaçant un morceau de feuille de téflon et le montage d'une nouvelle lame.
- Essuyez la culture de tissus (TC) hotte avec 70% d'éthanol et de mettre à l'intérieur microscope à dissection. Stériliser le capot, un microscope, trancheuse tissus et tous les instruments de dissection pendant 15 minutes avec la lumière UV.
- Préparez six des plaques TC. Ajouter 750 ul de milieux de culture tranche (SMC) par puits et le lieu inserts de culture cellulaire dans chaque puits. Assurez-vous que les membranes sont bien mouiller sans bulles en dessous. Placer les plaques dans une étuve à 35 ° C gazés avec 5% de CO 2 jusqu'à ce que nécessaire.
- Verser 50 ml de Na + à faible ACSF (dissection solution) dans un bécher de 100 ml et le placer sur la glace Mélanger le sel. Bubble la faible Na + ACSF avec 5% de CO 2 / 95% O 2 jusqu'au changement de couleur et de formes ACSF un mélange bouillie de solution congelée et liquide (10-20 min).
- Obtenir un rat P5-P7 chiot. Jusqu'à trois chiots peuvent être utilisés.
2. Hippocampique Préparation tranches.
- Coupez la tête de l'animal avec des ciseaux pointus d'utilité. Coupez la peau et exposer le crâne. Ouvrez le crâne par la coupe d'un côté à côte le long de la ligne interaural et puis le long de la suture sagittale avec de petits ciseaux. Une coupe en option d'un côté à l'avant peut être fait pour faciliter l'enlèvement de l'os et l'exposition du cerveau. Scoop sur le cerveau plus rapidement avec une spatule cuillère arrondie micro et le placer dans la bouillie de dissection solution à réfrigérer pendant environ 1 minute. Verser environ 10 ml de glace solution de dissection froide sur un plat de 60 mm et le transfert du cerveau du bécher à l'antenne. Le cerveau doit être recouvert d'dissection solution.
- Sous la loupe binoculaire: Placez le cerveau et le tenir à la ligne médiane avec les pinces à disséquer enfoncé au fond du plat de 60 mm. Utilisez l'outil de dissection hippocampe pour séparer les hémisphères laissant le mésencéphale. Les hippocampes sont ensuite exposés sur chaque hémisphère. Puis, doucement scoop de l'hippocampe avec l'hippocampe dissection outil. Utilisez l'aiguille à dissection pour isoler complètement l'hippocampe et le nettoyer autant que possible.
- En utilisant une pointe ciselée d'une pointe de pipette P1000 filtre, doucement aspirer l'hippocampe et le transférer à la feuille de téflon sur la trancheuse tissus. Position de l'hippocampe sur le côté concave.
- Aligner la perpendiculaire hippocampes à la lame d'obtenir des coupes coronales et drainer l'excès de liquide.
- Trancher le hippocampes toutes um 400.
- Verser 10 ml ~ froide SMC dans un plat de 60 mm et le transfert d'hippocampes en tranches la trancheuse en utilisant un autre ciselée P1000 filtre de la buse et le froid SMC. Évitez de faire des bulles.
- Avec l'aide de la spatule une iris et d'une spatule droites délicatement les tranches séparées les unes des autres.
- Séparée tranches bien définies et en bon état à partir de tranches endommagé.
3. Hippocampique Culture Slices
- Apportez les plaques de six puits avec SCM et les inserts de culture cellulaire de l'incubateur. Avec l'aide d'un autre ciselée P1000 bout filtre, le transfert de tranches individuelles sur la membrane. Placer les tranches de 4-5 par membrane. Soyez prudent de ne pas placer les tranches soit près du mur d'insérer ou de proches les uns des autres. Lorsque cela est nécessaire, utiliser une spatule d'iris à des tranches séparées. Retirer l'excès moyennes. Toucher tranches aussi peu que possible une fois qu'ils sont sur la membrane.
- Déplacer la plaque arrière d'incubateur et de la culture à 35 ° C et CO 2 5%.
- Changer SMC toutes les 48 heures à l'intérieur du capot de TC par l'aspiration du SMC avec une pipette Pasteur. Ajouter 750 ul de frais préchauffé SMC par puits. Assurez-vous qu'aucun des bulles se forment sous la membrane.
4. Solutions
- Faible Na + ACSF - Solution Dissection des cultures tranche
Pour désionisée et stérile H 2 O ajouter:Pour 500 ml Pour 1000 ml Concentration finale CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM D-glucose 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 ml 5 ml 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mM Saccharose 40 g 80 g 234 mm Phénol solution rouge de 0,5% dans DPBS 0,5 ml 1 ml 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
SterilIze par passage à travers du filtre 0.22μm
Faire 50 ml aliquotes et stocker à 4 ° C ne dépassant pas 2 mois. - Milieu de culture Slice (SCM)
Pour 500 ml Pour 1000 ml Concentration finale MEM Eagle Médium 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Cheval de chaleur sérum inactivé 100 ml 200 ml 20% L-glutamine (200 mM) 2,5 ml 5 ml 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 ml 2 ml 2 mM Insuline (1 mg / ml), dissous dans HCl 0,01 N 0,5 ml 1 ml 1 mg / l Acide ascorbique, la solution (25% p / v) 0,024 ml 0,048 ml 0,00125% D-glucose 1.16g 2.32g 13 mM NaHCO 3 0,22 g 0,44 g 5,2 mM Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Mélanger jusqu'à ce que complètement dissous et amener à température ambiante.
Ajuster le pH à 7.27 à 7.28 avec NaOH 1 N
Mesurer l'osmolarité. Ajuster à 320 mmol / kg avec déminéralisée et stérilisés H 2 O. Attendez-vous à ajouter environ 25 à 40 ml. Vérifiez à nouveau l'osmolarité.
*** PH peut changer légèrement tout en ajustant l'osmolarité, c'est ok, il est plus important que l'osmolarité est dans la plage correcte (317-323).
Stériliser par passage à travers filtre de 0,22 um.
Faire aliquotes de 20 ml et stocker jusqu'à deux ou trois semaines à 4 ° C.
Stock Gluatamine: préparer à une concentration de 200 mM et conserver à -20 ° C en aliquots de 2,5 mL.
Stock de l'acide ascorbique: préparer à une concentration de 25% (p / v) et conservés à -20 ° C en aliquots de 100 ul.
5. Les résultats représentatifs:
Tranches devrait ressembler blanc sous un microscope à dissection, sans taches noires et bien définis et CA1 intacts, CA3, et des régions gyrus denté. La contamination bactérienne est facile de voir que le déplacement des points noirs dans le milieu ou la turbidité de l'Accord SMC. Lorsqu'il est placé sous le microscope, la surface de la tranche devrait ressembler propre après 4 jours de culture avec des organismes à cellules claires et visiblement. Si aucun des organismes à cellules claires sont vus et beaucoup de débris couvre la surface après 4 jours, n'est donc pas une tranche saine.
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Discussion
Cette méthode est basée sur la première méthode décrite par Stoppini et al. 11 et offre une manière rapide à des tranches de la culture d'hippocampe. L'aspect le plus important de ce protocole est de maintenir les tranches stériles, c'est pourquoi il est essentiel d'utiliser les techniques appropriées de stériles et de bien désinfecter et stériliser tout le matériel en contact avec le tissu.
Différentes sources de sérums peuvent influencer la qualité des tranches. Nous recommandons de tester plusieurs lots d'abord. Si la contamination est un problème récurrent, vérifiez l'incubateur et le capot de la culture de tissus pour les sources possibles de contamination. L'utilisation correcte des techniques stériles durant toute la procédure est essentielle.
Le temps total de la décapitation de placer les tranches sur la membrane et dans l'incubateur ne devrait pas être plus long que 1,5 heures. Si la procédure est trop longue, elle risque de compromettre la santé des tranches.
Placer les tranches sur une membrane poreuse garanties oxygénation correcte et la nutrition par le biais d'une couche mince de SMC qui est formé par capillarité. Cette méthode peut être adaptée à d'autres régions cérébrales à condition que la densité du tissu permet une oxygénation correcte et la pénétration des nutriments. Ainsi, la densité des tissus limites de cette méthode à des tissus jeunes. Pour l'hippocampe, des tranches de 300 à 400 um d'épaisseur de P6-P7 animaux semblent donner de meilleurs résultats. Ce type de tranches peut être rapidement obtenue avec une trancheuse tissus diminuant le temps de le tissu est exposé à l'air.
Surtout pour ceux qui étudient la physiologie synaptique, après quelques jours de culture, tous les débris de cellules mortes a été enlevé, laissant une surface propre convient parfaitement pour des expériences électrophysiologiques ou d'imagerie. En outre, les coupes d'hippocampe organotypiques poursuivre le développement de la connectivité normale comparable à tranches aiguës 12. Cependant, après deux semaines dans la culture de cette connectivité normale disparaît comme les neurones commencent à se former trop de connexions qui augmente l'activité synaptique dans la tranche.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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