Summary
हम एक विधि का वर्णन है कि आसानी से अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता organotypic hippocampal स्लाइस तैयार. मस्तिष्क स्लाइसें झरझरा झिल्ली और एक अंतरफलक के रूप में की अनुमति दी है संस्कृति मीडिया पर रखी हैं. इस विधि संस्कृति में 2 सप्ताह के लिए हिप्पोकैम्पस के सकल वास्तुकला को बरकरार रखता है.
Abstract
हिप्पोकैम्पस, limbic प्रणाली के एक घटक, दीर्घकालिक स्मृति और स्थानिक नेविगेशन 1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. Hippocampal न्यूरॉन्स मजबूत सक्रियण के संक्षिप्त अवधि के बाद उनके कनेक्शन की ताकत को संशोधित कर सकते हैं. इस घटना, दीर्घकालिक potentiation (LTP) के रूप में जाना जाता घंटों या दिनों के लिए पिछले है और सबसे अच्छा सीखने और स्मृति 2 के लिए उम्मीदवार तंत्र बन सकता है. इसके अलावा, अच्छी तरह से परिभाषित और हिप्पोकैम्पस 3 का शरीर रचना विज्ञान कनेक्टिविटी यह एक शास्त्रीय मॉडल synaptic पारेषण और synaptic plasticity 4 अध्ययन प्रणाली बना दिया है.
Hippocampal synapses के फिजियोलॉजी के बारे में हमारी समझ के रूप में वृद्धि हुई है और आणविक खिलाड़ियों की पहचान बन गया, synaptic प्रोटीन में हेरफेर करने की जरूरत अनिवार्य हो गया. Organotypic hippocampal संस्कृतियों आसान जीन हेरफेर और सटीक औषधीय हस्तक्षेप के लिए संभावना की पेशकश लेकिन synaptic संगठन है कि दिनचर्या संस्कृति dissociated न्यूरॉन्स तरीकों की तुलना में एक अधिक प्राकृतिक संदर्भ में synapse समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है बनाए रखने.
यहाँ हम एक विधि को तैयार करने और संस्कृति hippocampal स्लाइस कि आसानी से अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता उपस्थित थे. इस विधि आनुवंशिक हेरफेर के लिए स्लाइस वायरल संक्रमण 5,6 या biolistics 7 की तरह अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए आसान पहुँच अनुमति देता है. इसके अलावा, स्लाइस जैव रासायनिक 8 assays के लिए आसानी से बरामद किया जा सकता है, या इमेजिंग 9 या electrophysiological 10 प्रयोगों के लिए सूक्ष्मदर्शी को हस्तांतरित.
Protocol
1. Hippocampal स्लाइस की तैयारी शुरू करने से पहले.
- Teflon चादर का एक टुकड़ा रखकर और एक नया ब्लेड बढ़ते ऊतक slicer तैयार करें.
- टिशू कल्चर हुड (टीसी) 70% इथेनॉल के साथ पोछो और विदारक माइक्रोस्कोप के अंदर सेट. डाकू, माइक्रोस्कोप, ऊतक slicer और पराबैंगनी प्रकाश के साथ 15 मिनट के लिए सभी विदारक यंत्र जीवाणुरहित.
- छह अच्छी तरह से टीसी प्लेटों की तैयारी. प्रत्येक अच्छी तरह से 750 μL संस्कृति टुकड़ा (SCM) मीडिया के प्रति अच्छी तरह से और जगह सेल संस्कृति आवेषण जोड़ें. सुनिश्चित करें कि झिल्ली नहीं नीचे के बुलबुले के साथ अच्छी तरह से गीला कर रहे हैं. इनक्यूबेटर में 35 पर प्लेटें प्लेस ° C 5% सीओ 2 के साथ मार डाला है जब तक की जरूरत है.
- एक 100 एमएल बीकर में 50 एमएल कम ना + ACSF (समाधान विदारक) डालो और बर्फ नमक के मिश्रण पर यह जगह. बुलबुला कम ना + ACSF 5% सीओ 2 / 95% 2 हे के साथ जब तक रंग परिवर्तन और ACSF स्थिर और तरल समाधान (10-20 मिनट) के घोल के मिश्रण रूपों.
- P5-P7 एक चूहे पिल्ला हो जाओ. ऊपर तीन पिल्ले इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. Hippocampal स्लाइस तैयार.
- तेज उपयोगिता कैंची के साथ पशुओं के सिर कट. त्वचा कट और खोपड़ी बेनकाब. Interaural रेखा के साथ पक्ष की ओर से काटने और छोटी कैंची से बाण के समान सीवन के साथ तो खोपड़ी खोलें. सामने एक पक्ष की ओर से वैकल्पिक कटौती हड्डियों और मस्तिष्क के जोखिम को हटाने की सुविधा के लिए बनाया जा सकता है. बाहर जल्दी मस्तिष्क और एक गोल चम्मच सूक्ष्म रंग के साथ स्कूप समाधान विदारक ~ 1 मिनट के लिए ठंड के घोल में जगह. एक 60 मिमी पकवान पर ~ बर्फ ठंड विदारक समाधान के 10 एमएल डालो और बीकर से पकवान मस्तिष्क हस्तांतरण. मस्तिष्क समाधान विदारक के साथ कवर किया जाना चाहिए.
- के तहत विदारक माइक्रोस्कोप: प्लेस मस्तिष्क और midline पर यह 60 मिमी पकवान के नीचे करने के लिए दबाया विदारक संदंश के साथ पकड़. हिप्पोकैम्पस विदारक उपकरण का उपयोग करने के लिए बाहर midbrain छोड़ने गोलार्द्धों अलग. hippocampi प्रत्येक गोलार्द्ध पर तो उजागर कर रहे हैं. फिर धीरे उपकरण विदारक हिप्पोकैम्पस के साथ हिप्पोकैम्पस बाहर निकालना. विदारक सुई का प्रयोग करने के लिए पूरी तरह से अलग हिप्पोकैम्पस और इसे जितना संभव हो साफ है.
- एक P1000 फिल्टर विंदुक टिप के एक snipped टिप का प्रयोग, धीरे हिप्पोकैम्पस aspirate और Teflon पत्रक के लिए ऊतक slicer पर स्थानांतरण. इसके अवतल तरफ हिप्पोकैम्पस स्थिति.
- ब्लेड से hippocampi सीधा संरेखित राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त है और तरल पदार्थ की अधिक नाली.
- Hippocampi हर 400 सुक्ष्ममापी स्लाइस.
- एक 60 मिमी पकवान और हस्तांतरण hippocampi दूसरे snipped P1000 फिल्टर टिप और ठंड SCM का उपयोग slicer से कटा हुआ में ~ 10 एमएल ठंड SCM डालो. बुलबुले बनाने से बचें.
- एक परितारिका रंग और एक सीधे रंग की मदद के साथ धीरे से एक दूसरे से स्लाइस अलग.
- क्षतिग्रस्त स्लाइस से अच्छी तरह से परिभाषित और undamaged स्लाइस अलग.
3. Hippocampal स्लाइसें संस्कृति
- SCM और इनक्यूबेटर से सेल संस्कृति आवेषण के साथ छह अच्छी तरह प्लेटें लाओ. दूसरे snipped P1000 फिल्टर टिप की मदद के साथ, झिल्ली पर व्यक्तिगत स्लाइस को हस्तांतरण. झिल्ली प्रति 4-5 स्लाइस रखें. जगह नहीं स्लाइस या तो डालने की दीवार को बंद करने या एक दूसरे के करीब सावधान रहें. जब आवश्यक हो, अलग स्लाइस परितारिका रंग का उपयोग करें. अतिरिक्त मध्यम निकालें. थोड़ा के रूप में संभव के रूप में में स्लाइस टच एक बार वे झिल्ली पर हैं.
- 35 इनक्यूबेटर करने के लिए वापस थाली और संस्कृति हटो डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- टीसी हुड के अंदर एक पाश्चर विंदुक के साथ SCM aspirating द्वारा SCM हर 48 घंटे बदलें. ताजा पूर्व गर्म अच्छी तरह से प्रति एससीएम के 750 μL जोड़ें. सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले झिल्ली के तहत गठित की गई हैं.
4. समाधान
- टुकड़ा संस्कृतियों के लिए विदारक समाधान - कम ना + ACSF
विआयनीकृत और बाँझ एच 2 हे जोड़ने के:500 एमएल के लिए 1000 एमएल के लिए अंतिम एकाग्रता 2 CaCl (एम 1) 0.5 एमएल 1 एमएल 1 मिमी डी ग्लुकोज .901 छ 1.802 ग्राम 10 मिमी KCl .149 छ .298 छ 4 मिमी 2 MgCl (एम 1) 2.5 एमएल 5 एमएल 5 मिमी 3 NaHCO 1.092 ग्राम 2.184 ग्राम 26 मिमी Sucrose 40 छ 80 छ 234 मिमी DPBS में Phenol लाल समाधान 0.5% 0.5 एमएल 1 एमएल 0.1% v / वी
~ मिक्स 30 मिनट
Steril0.22μm फिल्टर के माध्यम से पारित होने के द्वारा ize
4 डिग्री सेल्सियस अब 2 महीने की तुलना में 50 एमएल aliquots और दुकान बनाओ. - स्लाइस संस्कृति मध्यम (SCM)
500 एमएल के लिए 1000 एमएल के लिए अंतिम एकाग्रता सदस्य ईगल मध्यम 4.2 छ 8.4 छ 8.4 छ / एल हार्स सीरम गर्मी निष्क्रिय 100 एमएल 200 एमएल 20% एल Glutamine (200 मिमी) 2.5 एमएल 5 एमएल 1 मिमी 2 CaCl (एम 1) 0.5 एमएल 1 एमएल 1 मिमी MgSO 4 (एम 1) 1 एमएल 2 एमएल 2 मिमी (1 मिलीग्राम / एमएल) इंसुलिन, एचसीएल एन .01 में भंग 0.5 एमएल 1 एमएल 1 मिलीग्राम / l Ascorbic एसिड समाधान (25% w / ध्) 0.024 एमएल 0.048 एमएल 0.००,१२५% डी ग्लुकोज 1.16g 2.32g 13 मिमी 3 NaHCO 0.22g 0.44g 5.2 मिमी Hepes 3.58g 7.16g 30 मिमी
जब तक अच्छी तरह से भंग मिलाई और कमरे के तापमान पर लाने के लिए.
7.27-7.28 के लिए एन 1 NaOH के साथ पीएच समायोजित
उपाय osmolarity. विआयनीकृत और निष्फल एच 2 ओ के साथ 320 mmol / किलो समायोजित लगभग 25-40 एमएल जोड़ने की अपेक्षा करें. Osmolarity फिर से जाँच करें.
*** पीएच थोड़ा बदल जबकि osmolarity समायोजन हो सकता है, यह ठीक है, यह ज्यादा महत्वपूर्ण है कि osmolarity सही श्रेणी (317-323) में है.
0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित होने से जीवाणुरहित.
दो - तीन सप्ताह के लिए 4 बजे 20 एमएल aliquots और दुकान डिग्री सेल्सियस
Gluatamine शेयर: -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 मिमी और दुकान के एकाग्रता में 2.5 एमएल aliquots में तैयार.
Ascorbic एसिड शेयर: 25% (w / v) के एक एकाग्रता को तैयार करने और 100 μL की aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
स्लाइसें काले धब्बों के बिना एक विदारक गुंजाइश के तहत सफेद और देखना चाहिए अच्छी तरह से परिभाषित और undamaged CA1, CA3, और दांतेदार गाइरस क्षेत्रों. बैक्टीरियल संदूषण आसानी से मध्यम या SCM के turbidity में काले specks जाने के रूप में देखा जाता है. जब खुर्दबीन के नीचे रखा, टुकड़ा की सतह संस्कृति में 4 दिनों के बाद साफ स्पष्ट और discernibly सेल शरीर के साथ देखना चाहिए. यदि कोई स्पष्ट सेल शरीर को देखा है और बहुत मलबे 4 दिनों के बाद सतह को शामिल किया गया है, तो एक स्वस्थ टुकड़ा नहीं है.
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Discussion
इस विधि पहले Stoppini एट अल द्वारा वर्णित विधि पर आधारित है 11. और संस्कृति hippocampal स्लाइस के लिए एक तेजी से तरीके प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू स्लाइस बाँझ बनाए रखना है, इसलिए यह के लिए उपयुक्त बाँझ तकनीक का उपयोग करें और ठीक कीटाणुरहित और ऊतक के साथ संपर्क में सभी सामग्री बाँझ महत्वपूर्ण है.
विभिन्न serums स्रोतों स्लाइस की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. हम कई बैचों पहले परीक्षण सलाह देते हैं. यदि संदूषण एक आवर्ती समस्या है, मशीन और संदूषण के संभावित स्रोतों के लिए ऊतक संस्कृति हुड की जाँच करें. पूरी प्रक्रिया के दौरान बाँझ तकनीक के समुचित उपयोग जरूरी है.
कत्ल से झिल्ली पर और इनक्यूबेटर में स्लाइसें रखने के लिए कुल समय 1.5 घंटे से अधिक लंबी नहीं होना चाहिए. अगर प्रक्रिया भी लंबे समय लेता है, यह स्लाइस के स्वास्थ्य समझौता नहीं करेंगे.
कि कपिलैरिटि द्वारा बनाई है SCM की एक पतली परत के माध्यम से एक झरझरा झिल्ली वारंटी समुचित oxygenation और पोषण पर रखकर स्लाइस. इस विधि को अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए प्रदान करने कि ऊतक के घनत्व उचित oxygenation और पोषक तत्व प्रवेश की अनुमति देता है अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रकार, ऊतक घनत्व युवा ऊतकों को इस विधि की सीमा. हिप्पोकैम्पस के लिए, 300-400 सुक्ष्ममापी p6-p7 जानवरों से मोटी स्लाइसें के लिए सबसे अच्छा परिणाम दे रहे हैं. स्लाइस की इस प्रकार का एक ऊतक समय ऊतक हवा के संपर्क में है ह्रासमान slicer के साथ तेजी से प्राप्त किया जा सकता है.
Synaptic फिजियोलॉजी संस्कृति में कुछ दिनों के बाद, अध्ययन उन लोगों के लिए महत्वपूर्ण बात है, मृत कोशिकाओं से सभी मलबा हटा दिया गया है, एक साफ सतह electrophysiological या इमेजिंग प्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त छोड़ने. इसके अलावा, organotypic hippocampal स्लाइस सामान्य तीव्र 12 स्लाइस के लिए तुलनीय कनेक्टिविटी के विकास जारी है. लेकिन 2 हफ्तों के बाद इस संस्कृति में सामान्य कनेक्टिविटी गायब हो जाता है के रूप में न्यूरॉन्स भी कई कनेक्शन है कि टुकड़ा में synaptic गतिविधि बढ़ जाती है के गठन शुरू है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NINDS द्वारा वित्त पोषित - एनआईएच R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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