Summary
Метод ферментативной диссоциации, маркировка поверхности и очистки с помощью проточной цитометрии фиброзно / адипогенной и миогенной прародителей из мышиных скелетных мышцах.
Abstract
Скелетная мышца состоит из нескольких популяций предшественников различных эмбрионального происхождения и потенциала развития. Миогенный прародителей, как правило, проживающих в "спутниковые позиции ячейки" между мембраной myofiber плазмы и ламинин богатых базальной мембраны, что ensheaths это, говорят сами за себя обновление клеток, которые являются исключительно привержены миогенной 1,2 линии. Мы недавно описал второго класса судна связанные прародителей, которые могут генерировать миофибробластов и белых адипоцитов, который реагирует на повреждения за счет эффективного ввода пролиферацию и обеспечивает трофическую поддержку миогенной клеток в процессе регенерации тканей 3,4. Один из самых надежных тестов, чтобы определить области развития и регенеративный потенциал данной популяции клеток зависит от их изоляции и трансплантации 5-7. С этой целью мы оптимизировали протоколов для их очистки с помощью проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных мышцы, которые мы будем наброски в этой статье. Популяций полученные с помощью этого метода будет содержать либо миогенной или фиброзно / адипогенной колониеобразующих клеток: никаких других типов клеток, которые способны расширять в пробирке или выживания в естественных условиях доставки. Однако, когда эти группы населения используются сразу после сортировки для молекулярного анализа (например, QRT-PCR) необходимо иметь в виду, что только что сортируются подмножества может содержать и другие загрязнения клетки, которые не имеют возможности формирования колоний или прививка получателей.
Protocol
1. Ткани коллекции:
- Используйте мышей от 7 до 12 недель. Обычно, по крайней мере двух животных используются: одна заключается в создании FACS одноцветных контроля, необходимых для компенсации и для флуоресцентных-минус один образцы изотипа контроля. Другой действительного образца для сортировки.
- Усыпить мышей CO 2 ингаляции или в соответствии с протоколом этики выбора. Место мышей на бумажное полотенце, лицом вверх, и спрей с 70% этанола тщательно, чтобы предотвратить загрязнение с помощью мыши меха.
- Поднимите кожи в области живота щипцами, а затем сделать небольшой продольный разрез с острыми ножницами.
- Пил двух створок кожи в противоположных направлениях (вверх и вниз), чтобы полностью разоблачить задних мышц конечностей под ними.
- Акцизный мышечной ткани, вставив и расширение ножницы по обеим сторонам голени.
- Повторите тот же процесс для бедренной кости для извлечения мышечной ткани.
- Поместите все вырезали мышечной ткани в 60 мм чашках Петри, используя одно блюдо для ткани от каждой мыши.
- Повторите выше для всех мышей.
2. Диссоциируют ткани в отдельных клеток от ферментативного пищеварения:
В этой части протокола, используйте стерильные реактивы и инструменты и работать в стерильных условиях.
- Добавить 2 мл коллагеназы II (Sigma, кошка # 6885, 500U / мл) и 20 мкл 250 мм CaCl 2 акции каждый Петри-блюдо.
- Слеза мышечную ткань на мелкие кусочки (около 1 мм 3) с двумя щипцами (один зубчатые, одна с 2 зуба, от изобразительных инструментов науки, кот # 11051-10, 11154-10), обращая внимание на удалить и уничтожить столько загрязненных не-мышечной ткани, как это возможно.
- Обложка чашках Петри и инкубировать их на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Получить чашках Петри и использовать 3 мл шприца тщательно пюре ткани штук. Используйте один поршень для каждого образца, чтобы избежать загрязнения.
- Добавьте немного (~ 5 мл) стерильной холодном PBS каждому Петри блюдо и передачи ткани шлама в 50 мл трубки Falcon (полоскание Петри блюдо, если необходимо, чтобы восстановить все ткани)
- Встряхните трубки Сокол энергично, заполнить трубу с PBS, центрифуга @ 800rpm х 5 минут (Эппендорфа Настольная модель: 5810R), и аспирата супернатант (повторите 3 раза)
- Добавить 1 мл смеси Коллагеназа D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / мл) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / мл) и 10 мкл из CaCl 2 (250 мм) в каждую пробирку, инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с вращением в течение одного часа.
- Добавить 5-10 мл холодной, стерильные PBS, вихря и пипеткой тщательно гомогенизации ткани.
- Заполнение трубы с PBS и хорошо перемешать.
- Передача жидкости 40 мкм сито ячейка помещается в верхней части трубки 50 мл Сокол, чтобы отфильтровать оставшиеся крупные куски ткани. Разделите каждый образец равномерно на три 50 мл пробирки Falcon. Заполнение каждой из труб с PBS затем центрифуги @ 1600rpm в течение 5 минут на 8 градусов по Цельсию.
- Удалите супернатант и сбора клеток для окрашивания.
3. Окрашивание антител и сортировка:
В этой части протокола, используйте стерильные FACS и сбор буферов и работать в стерильных условиях. Коммерческая антител, как правило, считается стерильным, если надлежащим образом.
- Для одного цвета и образцы изотипа контроля, ресуспендируют образца в 1 мл буфера FACS и разделить приостановлено клетки в девяти 1,5 мл предварительно помечены труб Эппендорф (100 мкл каждой трубки).
- Настройка одного цвета окраски смеси в соответствии со следующей таблицей:
ВНИМАНИЕ: конечная концентрация антител изотипа контроля в пятно должно совпадать с первичными антителами их управления. Например, если анти-ССС-1 используется для 1 μg/10 6 ячеек, соответствующий изотипа должны использоваться в той же концентрации.Труба # Название трубки Компания Cat # клон изотипа разбавление 1 Номера для окраски 2 Hoechst33342 сигма B2261 2-5ug/ml 3 П. И. сигма P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC
CD45-FITCebioscience 11-0311-85 390 Крыса IgG2a 500 Дома сделаны I3 / 2 Крыса IgG2b 500 5 SCA1-PECY7 ebioscience 25-5981-82 D7 Крыса IgG2a 5000 6 α-7 APC Дома сделаны R2F2 Крыса IgG2b 1000 - Настройка изотипа контроль окрашивания смесей с помощью следующей таблицы:
Труба # Имя
трубHoechst П. И. CD31-
FITCCD45-
FITCSCAL-
PE-CY7-7-
APCКрыса-
IgG2b-
APCКрыса-
IgG2a-
pecy7Крыса-
IgG2a-
FITCКрыса-
IgG2b-
FITC7 Iso-
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 Iso-
SCAL-
pecy7+ + + + - + - + - - 9 Iso-
α-7-APC+ + + + + - + - - - - Внесите один элемент управления цветом и изотопного окрашивания смесей (мы обычно регулировать концентрацию антител, так что от 5 до 10 мкл окрашивании смесь добавляются к каждому образцу) в соответствующие трубки Эппендорф с шага 20. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 1 часа.
- Настройка одного цвета окраски смеси в соответствии со следующей таблицей:
- Пятно клетки от образца мышь с 800μL антитела коктейль (см. ниже) для сортировки ячейки СУИМ. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 1 часа.
Антитела коктейль: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC
ВНИМАНИЕ: оптимальное соотношение антител к клеткам должна определяться индивидуально титрования каждого антитела, так как значительные различия могут существовать между партиями. Оптимальное количество антител, которые будут использоваться должны быть выражены в μgs антител на 10 6 клеток-мишеней и поддерживается постоянным при использовании той же самой партии антител. Ясно, что если число клеток-мишеней существенно не изменяется между экспериментами, или, если окрашивание объема масштабируется с числом клеток, фиксированных разбавления каждого антитела также могут быть использованы. - Вымойте: Добавить примерно 1 мл FACS буфера для каждого из 9 труб контроля; добавить около 20 мл буфера FACS в пробирку.
- Центрифуга Eppendorf труб @ 3000rpm в течение 5 минут (Эппендорфа настольной центрифуге, Модель: 5417C). Центрифуга пробирку @ 1600rpm в течение 5 минут (Эппендорфа настольного центрифуг, модель: 5810R).
- Аспирацию и отбросить супернатант из всех труб.
- Ресуспендируют клеток в буфер FACS (1 мл для каждого из элементов управления, 4 мл для сортировки выборки), пипетки клеток в "трубах FACS" через ячейки сетчатого фильтра крышку (кошки BD Сокол # 352235, размер пор 40 мкм), чтобы удалить оставшиеся сгустки, которые могут влияют цитометр.
- Настройка сортировщика FACS с одним управления цветом и изотип управления.
- Сбор сортируются клетки в соответствии со следующей таблицей в 3,5 буфера коллекции мл (95% DMEM, 5% ЭТС) по отдельности. Как правило, при уборке обе задние конечности, один дикий тип мыши может принести около 150000 миогенной клеток-предшественников или 100000 адипогенной клеток-предшественников, с жизнеспособность выше 95%, если судить по reanalyzing отсортированных клеток FACS в конце процедуры (рис. 1 )
Определение миогенной и адипогенной прародителей на поверхностных окрашиваниеАнтитела / пятно Миогенный предшественников (МП) Адипогенной предшественников (AP) Hoechst + + П. И. - - CD31-FITC - - CD45-FITC - SCA1-PECY7 - + α-7 APC + -
4. Пересадка:
- Центрифуга отсортированные клетки @ 1500rpm в течение 5 минут, удалить супернатант и передачи клеткам автоклавного Эппендорф труб (1,5 мл), промыть клетки с 500 мкл стерильной PBS (без сыворотки!), То центрифуги @ 3000rpm в течение 5 минут. Поддержание всех реагентов в стерильных условиях и работающих в капот культуре тканей, ресуспендируют миогенной прародителей в ФСБ, или адипогенной предшественников в Матригель (BD кошка # 354234) примерно 10 6 кл / мл.
- Пересадка миогенной прародителей или адипогенной предшественников получателю мышей.
- Анестезировать мышь с isoflouran в соответствии с вашим учреждением политики.
- Бритье волос вокруг области инъекции, затем стерилизовать кожу путем втирания с 70% этанола
- Inject 20 мкл миогенной прародителей или адипогенной прародителей (= 20к клетки) с использованием 3 / 10 CC инсулиновый шприц (BD кошка # 309300).
- После соответствующего времени (три недели работает хорошо, но мышечные волокна выражения доноров полученных трансгенных маркеров обычно очевидны в течение одной недели после трансплантации), анестезировать получателя мышей с шага 29 на введении препарата в 400 мкл Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 мг / мл), затем заливать transcardially с 50 мл PBS (содержит 10 мкМ ЭДТА) первым, а затем 15 мл 4% PFA. Сбор ткани-мишени, после исправления с 4% PFA на ночь, если требуется, а затем перенести до 20% сахарозы в одночасье. Добавить в октябре, заморозить и cryosection.
5. Представитель Результаты:
Когда депутат пересаживают в скелетных мышцах мышей, они с готовностью предохранитель с уже существующими мышечные волокна. Поэтому любые генетические этикетке присутствует в донорских клеток можно будет легко обнаружить в волокна, которые их получили. На рисунке 2 показан пример, когда пересаженные клетки человека выразил щелочной phostphatase, показал гистохимически.
Когда AP пересаживают результат очень сильно зависит от среды сайта трансплантации: при трансплантации этих клеток подкожно дать происхождение адипоциты и миофибробластов (см. рисунок 2). Во многих других сайтов, включая мышцы, они не выживет, если жировая дистрофия была индуцированных 3.
Рисунок 1. Сортировка стратегии изоляции населения от предшественников скелетных мышцах () Сортировка стратегии:. Жизнеспособные клетки были определены на основе рассеяния вперед и боковые разброс. Hoechst окрашивания был использован, чтобы исключить безъядерные мусора и пропидий йодида (PI) окрашивание для исключения мертвых клеток. Гемопоэтических (CD45) и эндотелиальных (CD31) клеток были исключены из сортировки ворота. Α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - SCAL - подмножество содержит все миогенной прародителей (МП). SCAL + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - популяция содержит адипогенной прародителей (AP). (B) Флуоресценция-минус один (FMO) контролирует изотипа подтверждения специфичности пятно. (C) Чистота проверки МП и А. П. подмножества после сортировки.
Рисунок 2. Представитель результаты следующие MP и AP трансплантации. AP были пересажены подкожно (верхняя панель) и депутат внутримышечно (нижняя панель). В обоих случаях донорские клетки происходит от выражения трансгенные мыши человека щелочной фосфатазы, выявленные коричневого окрашивания.
Discussion
Целью этого протокола является разумный баланс между высокой урожайностью и высокой жизнеспособности очищенные клетки. Наиболее важным шагом в обеспечении того, чтобы здоровые клетки восстанавливаются является, как ожидается, ферментативной диссоциации начиная ткани. Обработка ткани должны быть особенно нежными, которое трудно доказать или оценить даже в аудиовизуальном формате. Другим ключевым фактором является длина процедуры. Больше времени требуется, чтобы перейти от донора до реципиента животное, тем ниже жизнеспособность и поэтому приживления эффективности. В случае возникновения вопроса о жизнеспособности, что не сразу ответил, глядя на частоте П. И. положительным событием в очищенных образцов ячейки после сортировки, мы полагаем, что анализ предельного разбавления для измерения clonogenicity осуществляется 3. Типичные виды из неповрежденной мышцы обычно выход у 1 из 15-20 клеток, способных инициировать миогенной или фиброзно / адипогенной колоний в пробирке. Хотя по существу, 100% от колонии инициированы депутатами содержат дифференцированные myotubes, только около одной трети колоний получены из ФАП содержат жировых клеток в дополнение к гладкой мускулатуре актина положительные миофибробластов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
