Summary
इस वीडियो वयस्क ड्रोसोफिला से एक मानक पूरे सेल प्रौद्योगिकी का उपयोग न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए तैयार करने में पूरे दिमाग अलग करने के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है. यह GFP लेबल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग के दौरान देखा की छवियों शामिल हैं.
Abstract
इस वीडियो में, हम वयस्क ड्रोसोफिला से एकल न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए तैयार करने में पूरे दिमाग अलग करने के लिए प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. हम विदारक समाधान और हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया वयस्क महिलाओं का कब्जा वर्णन द्वारा शुरू करते हैं. पूरे मस्तिष्क को अक्षुण्ण निकालने, दोनों ऑप्टिक lobes सहित, के लिए प्रक्रिया सचित्र है. Overlying ट्रेकिआ के विच्छेदन भी दिखाया गया है. पृथक मस्तिष्क न केवल छोटा है, लेकिन इस स्तर पर निपटने के लिए न्यूरॉन्स को नुकसान को रोकने में विशेष देखभाल की जरूरत है, जिनमें से कई ऊतक की बाहरी सतह के करीब हैं. हम बताते हैं कि हम विकसित एक विशेष धारक रिकार्डिंग कक्ष में मस्तिष्क को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सेट एक मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एकल न्यूरॉन्स या जोड़े से न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. एक फ्लोरोसेंट छवि, रिकॉर्डिंग माइक्रोस्कोप के माध्यम से एक GAL4 (GH146) दिखाता है कि कैसे प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) रहते हैं मस्तिष्क में पहचाने जाते हैं GFP अभिव्यक्ति ड्राइविंग लाइन से देखा. एक उच्च शक्ति Nomarski छवि है कि पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित किया जा रहा है एक न्यूरॉन के एक दृश्य दिखाता है. जब सफलतापूर्वक मस्तिष्क क्षति के बिना हटा दिया जाता है, न्यूरॉन्स के बहुमत अनायास सक्रिय हैं, कार्रवाई क्षमता और / या सहज synaptic इनपुट प्रदर्शन फायरिंग. सीटू की तैयारी, जो पूरे दिमाग में न्यूरॉन्स की पहचान के पूरे सेल रिकॉर्डिंग आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के साथ संयुक्त किया जा सकता है है में यह वयस्क CNS में सेलुलर फिजियोलॉजी और plasticity की खोज के लिए एक उपयोगी मॉडल है.
Protocol
मैं दिमाग के वयस्क मक्खी से विच्छेदन
- एक 35 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में समाधान विदारक का एक छोटा सा ड्रॉप (~ 100 μl) रखें.
- वयस्क मादा का उपयोग Aspirator पकड़ो. खुर्दबीन विदारक के तहत, दो सिरिंज सुई का उपयोग करने के लिए मक्खी सिर काटना.
- विदारक खारा का एक छोटा सा (के साथ papain जोड़ी) एक पेट्री डिश में ड्रॉप में रखें सिर.
- स्थिति पकवान के नीचे का सामना करना पड़ सूंड के साथ साथ सिर.
- एक सुई के साथ छोड़ दिया यौगिक आँख को कवर छल्ली पकड़ो. एक विकर्ण में कटौती है कि पृष्ठीय से 2 सुई, बस एक सुई के लिए औसत दर्जे के साथ ventral सतह फैली.
- एक सुई के साथ mouthparts पकड़ो और 2 सुई का उपयोग करने के लिए एक क्षैतिज कटौती है कि बाईं आंख के ventral सतह से सही नज़र सूंड के आधार के स्तर पर फैली.
- एक सुई के साथ सही यौगिक आँख को कवर छल्ली पकड़ो. एक विकर्ण में कटौती है कि पृष्ठीय से 2 सुई है, बस एक सुई के औसत दर्जे के साथ ventral सतह फैली.
- सिर घुमाएँ ताकि व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष पेट्री डिश की सतह पर है. व्याख्यान चबूतरे वाला छल्ली और मस्तिष्क के बीच एक सुई डालें, और 2 सुई का उपयोग करने के लिए पहली सुई के रूप में एक ही मार्ग का अनुसरण. आदर्श रूप में, कैप्सूल छील दोनों ऑप्टिक इन के बाद से जुड़ी lobes के साथ मस्तिष्क से दूर हो रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क को स्थिर करने में महत्वपूर्ण हैं.
- ट्रेकिआ, हवा की थैलियों, और अन्य संयोजी ऊतक ध्यान से दो ठीक टिप संदंश का उपयोग कर हटा रहे हैं.
- पूरे विच्छेदन 3-10 मिनट लग चाहिए
द्वितीय. सीएनएस बढ़ते
- मस्तिष्क रिकॉर्डिंग कक्ष एक पीले टिप pipet का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित किया है.
- रिकॉर्डिंग कक्ष में, मस्तिष्क प्लैटिनम ऐसी है कि दो ठीक पार बाल ऑप्टिक lobes और केंद्रीय मस्तिष्क क्षेत्र के बीच जंक्शन पर ऊतक के साथ संपर्क बनाने के फ्रेम रखकर स्थिर है.
- प्रत्येक मस्तिष्क oxygenated खारा के साथ निरंतर छिड़काव (95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) के साथ रिकार्डिंग कक्ष में कम से कम 10 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दी है. Oxygenated खारा के साथ चैम्बर के छिड़काव रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान जारी रखा है. और Nomarski प्रकाशिकी के एक निश्चित स्तर और एक 40x पानी विसर्जन (; संख्यात्मक एपर्चर 0.8 Zeiss Achroplan) उद्देश्य के साथ, तैयार एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (Zeiss, Oberkochen, जर्मनी Axioskop 2FS) का उपयोग कर कल्पना है. GFP एक बी.पी. 505-530 प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ देखा गया था.
III. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी
- 8-14 Mohms के Pipets पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है
- वर्तमान दबाना और वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग एक EPC7 सूची या एक Axopatch 200B एम्पलीफायर, एक Digidata 1322A डीए कनवर्टर (आण्विक डिवाइसेज, फोस्टर शहर, सीए), एक Dell परिमाण 8200 कंप्यूटर (Dell कंप्यूटर, राउंड रॉक TX) का उपयोग करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और 9 सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण) pClamp.
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Discussion
पृथक पूरे मस्तिष्क तैयारी हम इस वीडियो में उदाहरण देकर स्पष्ट करना सेलुलर excitability और घ्राण प्रसंस्करण रास्ते में वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क (गुजरात और हे Dowd, 2006) में, उन सहित पहचान की न्यूरॉन्स, में synaptic प्रसारण अंतर्निहित तंत्र के मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण बरकरार वयस्क ड्रोसोफिला (विल्सन एट 2004 सभी) के मस्तिष्क में neuronal गतिविधि के अध्ययन के लिए पूरक है, एक स्तनधारी मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स से ज्यादा उसी तरह रिकॉर्डिंग में जाग बर्ताव स्तनधारियों में रिकॉर्डिंग करने के लिए पूरक हैं. सीटू उड़ मस्तिष्क तैयारी में दो प्रमुख लाभ जब स्तनधारी स्लाइस की तुलना कर रहे हैं. पहले पूरे मक्खी के मस्तिष्क रिकॉर्डिंग चेंबर में आसानी से फिट बैठता है तो यह एक बड़ा तंत्रिका सर्किट कि तब होता है जब स्तनधारी मस्तिष्क स्लाइसें बनाने से एक ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा आबकारी करने के लिए आवश्यक नहीं है. इसलिए पृथक Drospohila मस्तिष्क के भीतर neuronal सर्किट काफी हद तक बरकरार रहेगा. दूसरे, न्यूरॉन्स की सबसे सेल शरीर मस्तिष्क की सतह के निकट हैं, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए आसानी से सुलभ है और वे कार्यात्मक सक्रिय रहता है जब लगातार कई घंटे के लिए oxygenated खारा साथ perfused.
एक गिलास नीचे रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग करना भी उनके स्थान और / या GFP अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट न्यूरॉन्स की पहचान की अनुमति देता है. इस तैयारी में छिड़काव के दौरान रिकॉर्डिंग मस्तिष्क के स्थिरीकरण की आवश्यकता है. यह रणनीतिक रखा सोने के तार या नायलॉन जाल सहित मानक प्रक्रियाओं,, कि hippocampal स्लाइस जैसे ऊतकों के लिए प्रभावी रहे हैं पूरे मस्तिष्क (~ 1mm) के छोटे आकार के कारण के साथ संगत नहीं है. इसलिए हम एक प्लैटिनम फ्रेम और नायलॉन पार बाल केवल दो स्थानों में मस्तिष्क संपर्क करने के लिए मस्तिष्क की सतह के निकट स्थित न्यूरॉन्स को नुकसान को कम करने के लिए तैनात के साथ एक डिजाइन धारक. यह या तो पूर्वकाल या पीछे सतह का सामना करना पड़ रहा है और विपरीत बस हल्के रिकार्डिंग कक्ष के फर्श पर आराम की सतह के साथ मस्तिष्क, स्थिर. इस डिवाइस का उपयोग हम के लिए नियमित रूप से एक घंटे तक के लिए, यहाँ तक कि Kenyon कोशिकाओं सहित छोटे न्यूरॉन्स से स्थिर पूरे सेल रिकॉर्डिंग को बनाए रखने, जबकि औषधीय जोड़तोड़ कि विशिष्ट दवाओं के स्नान आवेदन की आवश्यकता कर सकते हैं. धारक भी नवजात कृन्तकों से रीढ़ की हड्डी में स्लाइस के रूप में electrophysiological अध्ययन के लिए अन्य छोटे ऊतकों के नमूनों को हासिल करने में उपयोगी होना चाहिए.
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Acknowledgments
यह काम एक NIH अनुदान DKOD NS27501 द्वारा समर्थित किया गया. इस काम के लिए अतिरिक्त समर्थन एक HHMI प्रोफेसर कार्यक्रम DKOD अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Foceps | Tool | Fine Science Tools | No. 11251-10 | Be careful, never damage the fine tips of forceps |
| Papain | Reagent | Worthington Biochemical | 3126 | 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine |
| Dissecting microscope | SMZ-2B Model:C-PS | Nikon Instruments | Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle | |
| Needle & Syringe | PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co | 305175 & 309602 | Cheap and durable | |
| Upright microscope | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp | |
| Patch clamp amplifier | 200 B | Molecular Devices | ||
| Digidata D-A converter | 1322A | Molecular Devices |
References
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
