Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

Summary

Este video muestra el procedimiento para el aislamiento de los cerebros de los adultos Drosophila todo en la preparación para la grabación de las neuronas individuales utilizando la tecnología estándar de células enteras. Incluye imágenes de las células GFP etiquetados y las neuronas visto durante la grabación.

Abstract

En este vídeo, que muestran el procedimiento para el aislamiento de los cerebros de los adultos Drosophila todo en la preparación para la grabación de las neuronas individuales. Comenzamos con la descripción de la solución de disección y captura de las hembras adultas utilizadas en nuestros estudios. El procedimiento para la eliminación de todo el cerebro intacto, incluidos los lóbulos ópticos, se ilustra. La disección de la tráquea, que cubre también se indica. El cerebro aislado no sólo es pequeño, pero necesita un cuidado especial en el manejo en esta etapa para evitar daños a las neuronas, muchas de las cuales están cerca de la superficie exterior del tejido. Se muestra cómo un soporte especial que hemos desarrollado se utiliza para estabilizar el cerebro en la cámara de grabación. A electrofisiología estándar establecido se utiliza para la grabación de las neuronas individuales o pares de neuronas. Una imagen de fluorescencia, se ve a través del microscopio de grabación, a partir de una línea GAL4 conducir la expresión de GFP (GH146) ilustra cómo las neuronas de proyección (PN) se identifican en el cerebro en vivo. Una imagen de alta potencia Nomarski muestra una vista de una única neurona que está en la mira para la grabación de células enteras. Cuando el cerebro se elimina con éxito, sin daños, la mayoría de las neuronas se activa espontáneamente, disparando los potenciales de acción y / o exhibir la entrada sináptica espontánea. Esta en la preparación in situ, en el que se puede grabar de células enteras de neuronas identificadas en todo el cerebro combina con la manipulación genética y farmacológica, es un modelo útil para estudiar la fisiología celular y la plasticidad en el sistema nervioso central adulto.

Protocol

I. La disección del cerebro de la mosca adulta

1. Coloque una pequeña gota (~ 100 l) de la disección de una solución en el centro de una placa de Petri de 35 mm.
2. Captura de mujeres adultas con aspirador. Bajo microscopio de disección, se utilizan dos agujas de jeringas para decapitar a la marcha.
3. Coloque la cabeza en una pequeña gota de solución salina de disección (con papaína es nuestro) en una placa de Petri.
4. Posición de la cabeza con la trompa hacia abajo con el plato.
5. Mantenga la cutícula que recubre el ojo compuesto de la izquierda con la aguja 1. Haga un corte diagonal que se extiende desde la parte dorsal de la superficie ventral con aguja 2, justo por dentro de aguja 1.
6. Mantenga las piezas bucales con la aguja 1 y 2 el uso de agujas para hacer un corte horizontal que se extiende desde la superficie ventral del ojo izquierdo al ojo derecho, a nivel de la base de la trompa.
7. Mantenga la cutícula que recubre el ojo compuesto de la derecha con aguja 1. Haga un corte diagonal que se extiende desde la parte dorsal de la superficie ventral con aguja 2, justo medial de la aguja 1.
8. Gire la cabeza para que la parte rostral se encuentra en la superficie de la placa de Petri. Inserte la aguja 1 entre la cutícula y rostral del cerebro, y el uso de agujas de 2 a seguir el mismo camino que la primera aguja. Lo ideal sería que la cápsula se desprenda del cerebro con dos lóbulos ópticos unidos, ya que estos son importantes en la estabilización del cerebro para la grabación.
9. La tráquea, los sacos de aire, y otros tejidos conectivos se retira cuidadosamente el uso de dos pinzas de punta fina.
10. Disección entero debe tomar 30-10 minutos

II. Montaje del sistema nervioso central

1. El cerebro se transfiere a la cámara de grabación con una pipeta de punta amarilla.
2. En la cámara de grabación, el cerebro se estabiliza mediante la colocación de la estructura de platino tal que dos cruces bien ponerse en contacto con el tejido en la unión entre los lóbulos ópticos y la región central del cerebro.
3. Cada cerebro se deja reposar en la cámara de grabación con la perfusión continua con solución salina oxigenada (95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono) durante al menos 10 minutos. La perfusión de la cámara con solución salina oxigenada se continúa durante toda la filmación. La preparación es visualizado utilizando un microscopio vertical (Axioskop 2FS, Zeiss, Oberkochen, Alemania) con un escenario fijo y un objetivo de inmersión en agua 40x (Achroplan, apertura numérica, 0,8; Zeiss) y la óptica Nomarski. GFP fue visto con un filtro de BP 505-530 de fluorescencia.

III. Electrofisiología

1. Pipetas de 8.14 Mohms se utilizan para las grabaciones de células enteras
2. Grabaciones actuales-pinza y pinza de voltaje, se llevan a cabo utilizando una lista de EPC7 o un amplificador Axopatch 200B, un Digidata 1322A convertidor DA (Molecular Devices, Foster City, CA), un Dell Dimension 8200 PC (Dell Computer, Round Rock, TX), y pCLAMP 9 software (Molecular Devices).

Discussion

La preparación aislada de todo el cerebro se ilustra en este video permite la evaluación de los mecanismos celulares subyacentes a la excitabilidad y la transmisión sináptica en las neuronas identificadas, incluidas las de las vías de procesamiento olfativo en el cerebro adulto de Drosophila (Gu y Dowd O, 2006). Este enfoque es complementario al estudio de la actividad neuronal en el cerebro de un adulto intacto Drosophila (Wilson et 2004, todos), en la mayor parte de la misma manera que las grabaciones de las neuronas en una parte del cerebro de mamíferos son complementarias a las grabaciones en los mamíferos despierto comportarse. Hay dos ventajas principales de la preparación in situ de cerebro de la mosca en comparación con las rodajas de mamíferos. Primero, el cerebro de la mosca entera cabe fácilmente en la cámara de grabación, por lo que no es necesario extirpar un pequeño trozo de tejido de un circuito neuronal mayor que cuando está haciendo rodajas de mamíferos el cerebro. Por lo tanto, los circuitos neuronales en el cerebro aislado Drospohila permanecen casi intactos. En segundo lugar, los cuerpos celulares de la mayoría de las neuronas se encuentran cerca de la superficie del cerebro, de fácil acceso para el registro de célula entera y siguen siendo funcionalmente activa cuando continuamente perfundidos con solución salina oxigenada durante varias horas.

El uso de un fondo de cristal, cámara de registro también permite la identificación de neuronas específicas en función de su ubicación y / o la expresión de GFP. En esta preparación, la grabación durante la perfusión requiere la estabilización del cerebro. Esto no es compatible con los procedimientos habituales, incluyendo hilo de oro colocadas estratégicamente o malla de nylon, que son eficaces para los tejidos, tales como cortes de hipocampo, debido al pequeño tamaño de todo el cerebro (~ 1 mm). Por lo tanto, un soporte diseñado con un marco de platino y los pelos de nylon cruz colocada en contacto con el cerebro en sólo dos lugares para minimizar el daño a las neuronas localizadas cerca de la superficie del cerebro. Esto estabiliza el cerebro, ya sea con la superficie anterior o posterior hacia arriba y la superficie opuesta sólo ligeramente apoyada en el suelo de la cámara de grabación. El uso de este dispositivo que es capaz de mantener la rutina estable grabaciones de células enteras de hasta una hora, incluso de las neuronas pequeñas, incluyendo las células Kenyon, al hacer las manipulaciones farmacológicas que requieren aplicación del baño de fármacos específicos. Asimismo, el titular debería ser útil en la obtención de otras pequeñas muestras de tejido para estudios electrofisiológicos como rebanadas de la médula espinal de roedores recién nacidos.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices