Summary
Ett optimerat protokoll för isolering av stamceller från mus spottkörteln beskrivs. Metoden använder enzymatiska och mekaniska matsmältningen, och tillåter isolering av salispheres som innehåller celler med egenskaper av stamceller.
Abstract
Mogna spottkörtlar för både människors och mus ursprung bestå av minst fem celltyper, som alla underlättar produktion och utsöndring av saliv i munhålan. Serös och slemhinnor acinar celler är det protein och slemhinnor producerar fabriker av körteln respektive och representerar ursprung salivproduktion. När syntetiseras, är de olika enzymatiska och andra proteinrika komponenter i saliv utsöndras genom en serie av duktal celler med epiteliala-typ morfologi, tills den slutligen fördrivningen av saliv genom en stor kanal in i hålrummet i munnen. Sammansättningen av saliven också ändras av duktal celler under denna process.
I manifestationen av sjukdomar som Sjögrens syndrom och i vissa kliniska situationer såsom strålbehandling för huvud-och halscancer salivproduktion från körtlar minskar dramatiskt 1,2. Den resulterande muntorrhet, en subjektiv känsla av muntorrhet, påverkar inte bara patientens förmåga att svälja och tala, utan främjar också utvecklingen av karies och kan vara socialt handikappande för patienten.
Restaureringen av salivproduktion i de ovan nämnda kliniska förhållanden utgör därför en otillfredsställda kliniska behov och som sådan ett flertal studier har visat på förnyelseförmåga spottkörtlarna 3-5. Vidare till isolering av stamceller-liknande populationer av celler från olika vävnader i musen och mänskliga kroppar 6-8 har vi visat med hjälp av den beskrivna metoden att stamceller isolerade från musen spottkörtlar kan användas för att rädda salivproduktion i bestrålade saliv körtlar 9,10. Denna upptäckt banar väg för utvecklingen av stamceller terapier för behandling av xerostomic förhållanden hos människor, och även för undersökning av spottkörtlarna som en mikromiljö som innehåller celler med multipotenta själv förnya kapacitet.
Protocol
1. Regent Förberedelser
- Buffert: 1% (w / v) bovint serumalbumin i Hanks balanserade saltlösning
- Rekonstituera enzymer. Hyaluronidas enzym: 40 mg / ml, upplöst i bufferten. Kollagenas II: 23 mg / ml, upplöst i bufferten. Använd nyberedda enzym lösningar färska för varje isolering. När upplöst, förvara vid 4 ° C fram till användning för matsmältningen.
- 50 mM kalciumklorid i destillerat vatten. Filtrera sterilisera genom en 0,2 um porstorlek filter.
- Mus salivkörtlarna (MSG) odlingsmedium: DMEM: F12 med penicillin (100 IU / mL), streptomycin (100 mikrogram / ml), glutamax (2 mm), epidermal growth factor-2 (20 ng / ml), fibroblast tillväxtfaktor -2 (20 ng / ml), N2 tillägg (1%), insulin (10 mikrogram / ml) och dexametason (1 M).
2. Mekanisk och Enzymatisk Tissue Digestion
- Väg dissekerade spottkörtlar.
- Hacka körtlar till ett homogent pappersmassa med användning av steril böjd dissektion sax i en liten petriskål.
- Samla malet vävnad i 14 ml rör med 1 mL buffert per 80 mg submandibular vävnad. Skölj petriskålar rent av vävnad med hjälp av några av bufferten.
- Lägg till ytterligare 1 mL buffert per 80 mg vävnad, följt av 25 mikroliter kollagenas II enzym lösning, 25 mikroliter hyaluronidas enzym lösning och 250 mikroliter kalciumkloridlösningen per 80 mg vävnad. Om att arbeta med stora mängder vävnad, steg från 2,4 till 2,9 kan utföras i T25 flaskor vävnadsodling för enkelhetens skull.
- Inkubera i en skakande vattenbad inställd på 37 ° C i 20 minuter. Ta bort rören och kör med pipett att blanda enzymet grundligt igenom vävnaden igen.
- Byt i vattenbad i ytterligare 20 minuter.
- Samla vävnad genom centrifugering vid 400 xg, i 8 minuter. Kassera supernatanten.
- Resuspendera i 2 ml buffert för varje 80 mg vävnad och upprepa enzym och kalciumklorid tillägg enligt ovan. Inkubera 20 minuter i skakvattenbad. Ta bort rören och kör med pipett att blanda enzymer ordentligt.
- Inkubera sista 20 min i skakvattenbad. Samla cellerna genom centrifugering som ovan, kassera supernatanten.
3. Tvätt steg
- Resuspendera varje 80 mg av vävnad i 2 ml buffert och pipett för att tvätta vävnad utan enzymer.
- Centrifugera som tidigare att samla in. Kassera supernatanten.
- Upprepa Tvätta med 1 ml buffert per 80 mg vävnad. Centrifugera att samla in, kassera supernatanten.
4. Filtrering
- Resuspendera vävnad lösning i 1 mL buffert per 80 mg vävnad.
- Tillsätt lösning på 100 ìm por-storlek filtret placeras över 50 ml Falcon rör. Applicera inte mer än 3 ml av malet vävnad lösning per kolumn, som filter kan bli blockerade. Låt sippra igenom. Ta bort filtreras material som hänger på undersidan av filtret med pipett, och lägga till filtratet.
- Använd spruta med 26 gauge nål för att ta filtrat från 50mL rör och gäller för 50 ìm porstorlek filter på 5 ml rör. Låt filtrera genom, att hjälpa genom att lossa locken vid behov.
- Centrifugrör som tidigare att samla in. Kassera supernatanten.
5. Plating och Medium
- Kombinera alla pellets i en volym. Räkna med hjälp av automatiserade celltalsräknare eller haemocytometer.
- Tavla celler vid täthet av 0,4 x 10 6 celler per brunn av 12-brunnar, eller 2,67 x 10 6 celler per T25 vävnadskultur kolv. Tillsätt 1 medelstor ml MSG till varje brunn eller 6 ml till varje T25 kolven.
- Inkubera vid 37 ° C. Sfärer bör vara klart synliga för dag 2.
6. Representativa resultat:
Efter två till tre dagar i kultur, kommer små aggregat av celler (salispheres) synas i de kulturer. Salispheres kommer att fortsätta att växa i storlek under en period av tio dagar i kulturen. Representant faskontrast mikroskopi bilder av salispheres visas i figur 1. Celler som förökar uttrycker stamceller-associerade markör proteiner kan isoleras från dessa områden, optimalt mellan dag 3-5 efter isolering och kan differentiering till funktionella, saliv producerande acinar celler.
Figur 1. Salisphere bildas in vitro. Efter mekanisk och enzymatisk spjälkning med hjälp av det nuvarande protokollet kan sfärer av ökande storlek finns i flytande kulturer. Panelerna är representativa faskontrast mikroskopi bilder av kloten från dag 0 (A), 4 (B), 7 (C) och 10 (D). Skala bar = 50 ìm.
Discussion
Den vävnadskultur metod som beskrivs här utgör en reproducerbar protokoll för isolering av stamceller som innehåller salispheres från spottkörtlarna hos möss. Studier med celler som isolerats på detta sätt har lyft fram förnyelseförmåga saliv celler körtel stamceller 9. Transplantation av hundra av c-Kit + celler som härrör från salispheres inducerad funktionell återhämtning av bestrålat musen spottkörtlar. Dessa data är spännande och ge en startpunkt för utredning av stamcellsbaserad terapi för muntorrhet. Många vägar kvar att utforska dock, inklusive full markör proteinuttryck profil stamceller, förmåga submandibular körtlar att rädda funktion bestrålade parotideallymfknutorna spottkörtlar och vice versa, och karakterisering av den förmodade in vivo stamceller nisch av cellerna. Ytterst är översättningen av detta protokoll till mänskliga vävnadsprover och den efterföljande potential för behandling av muntorrhet hos människor med hjälp av isolerade celler de mest spännande tillämpning av den beskrivna metoden.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
- Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
- Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
- Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
- Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
- Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
- Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
- Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
- Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
- Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
- Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).
