Summary
يوصف أسلوب مرن وفعال للتوصيف توطين الخلية البروتين من نوع معين والنواة للهيولى مكوكية. هذا النهج يستخدم متغايرة النوى البروتينات الانصهار fluorescently المسمى لتعريب صورة بعد انصهار بروتين الخلية. بروتوكول غير قابلة للتعريب والمطرد للدولة أو تحديدات أكثر ديناميكية تقوم على تصوير الخلايا الحية.
Abstract
ويتم تنظيم عدد كبير من البروتينات عن طريق الاتجار أو التحت خلوية nucleocytolasmic مكوكية. هذه البروتينات عرض مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية النووية بما في ذلك استيراد / تصدير RNA والبروتين ، وتنظيم النسخي ، وموت الخلايا المبرمج. ومن المثير للاهتمام ، بما في ذلك إعادة تنظيم الخلوية الرئيسية انقسام الخلايا ، والتمايز والتحول ، وغالبا ما تنطوي على مثل هذه الأنشطة 3،4،8،10. يمكن للدراسة مفصلة لهذه البروتينات وآلياتها التنظيمية ذات الصلة كما يمكن أن يكون تحديا لتحفيز هذه التغييرات يمكن توطين بعيد المنال ، والحركات نفسها أن تكون دينامية للغاية ويصعب تتبع. الدراسات التي تنطوي على oncogenesis الخلوية ، على سبيل المثال ، الاستمرار في الاستفادة من مسارات التفاهم والأنشطة التي تختلف البروتين بين الخلايا الطبيعية والخلايا الأولية تحولت 6،7،11،12. كما تظهر العديد من البروتينات التعريب غيرت خلال التحول أو نتيجة للتحول ، وأساليب تتسم بكفاءة هذه البروتينات ، والمسارات التي تشارك فيها موقف لتحسين فهم oncogenesis ومجالات جديدة تفتح لمكافحة المخدرات والاستهداف.
هنا نقدم طريقة لتحليل البروتينات والاتجار في رحلات مكوكية بين نشاط خلايا الثدييات الأولية وتحويلها. هذا الأسلوب يجمع بين جيل من اندماج متغايرة النوى مع مضان المجهري لتوفير بروتوكول مرنة يمكن استخدامها للكشف عن البروتين تعريب وثابتة للدولة أو حيوية. كما هو مبين في الشكل 1 ، transfected عابر نوعين خلية منفصلة مع ثوابت بلازميد يحمل جينات fluoroprotein تعلق على الجينات في المصالح. بعد التعبير ، وتنصهر في الخلايا باستخدام مادة البولي ايثيلين جلايكول ، ويجوز عندئذ تعريب البروتين يمكن تصوير باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. بروتوكول المقدمة هنا هو النهج الأساسي الذي يمكن أن تضاف التقنيات المتخصصة.
Protocol
1. ترنسفكأيشن خطوط الخليوي
أسلوب ترنسفكأيشن 1
(Lonza Nucleofection لزيادة كفاءة الخلية الأولية ترنسفكأيشن)
- وينبغي أن تكون خلايا للمرور مؤخرا والنمو في المرحلة السابقة لتسجيل ترنسفكأيشن. غسل الخلايا في phophate مخزنة المالحة (PBS) والخلايا التي trypsinization الحصاد.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق.
- إضافة إلى تعقيم تغطية زلات لوحة 6 - جيدا. قد تكون مغلفة زلات غطاء لخلية التصاق المحسنة. مكان 1.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة (في هذه الحالة المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)) في كل بئر ويوازن وسائل الإعلام في الحاضنة.
- حصاد الخلايا trypsinization وresuspend في حجم الحد الأدنى من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي المبلغ الصحيح من إعادة تعليق على توفير ~ 5x10 5 خلايا لكل عينة.
- Resuspend الخلايا بعناية في 100 غرفة حل ميكرولتر Nucleofector درجة الحرارة في العينة.
- تجمع 100 ميكرولتر من الحمض النووي مع تعليق الخلية 5 ميكروغرام البلازميد ونقل العينة إلى كوفيت Nucleofector الحرص على عدم تضمين فقاعات الهواء.
- اختيار البرنامج المناسب Nucleofector (وهذا قد يتطلب التجارب السابقة لإنشاء الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن مع الحد الأدنى من الوفيات).
- إدراج كفيت يحتوي على تعليق خلية / الحمض النووي في هولدر كوفيت Nucleofector والبدء في البرنامج المحدد.
- عند الانتهاء ، إزالة كفيت وإضافة ~ 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة ما قبل معايرتها له (مأخوذة من لوحة 6 أيضا).
- نقل على الفور إلى لوحة عينة 6 بشكل جيد مع الحجم النهائي من 1.5 مل لكل بئر. وينبغي في أي من الخلايا مطلي السكان مختلطة أو منفصلة عن الضوابط.
أسلوب ترنسفكأيشن 2
(Qiagen Effectene ترنسفكأيشن لخطوط الخلية)
- تعد المجمعات ترنسفكأيشن باستخدام الكاشف Effectene Qiagen بإضافة first 0.8 ميكروغرام لكل عينة DNA البلازميد الى 200 ميكروليتر EC العازلة.
- إضافة 6.4 كاشف محسن ميكرولتر لكل عينة ، مزيج لفترة وجيزة عبها الأنبوب ، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 20 ميكرولتر Effectene كاشف لكل المزيج ، العينة عبها الأنبوب ، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- خلال هذه الحضانة ، وإعداد خطوط الخلايا اثنين من الفائدة للترنسفكأيشن. غسل خلايا passaged مؤخرا (<التقاء ٪ 80) مرة واحدة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 1.5 مل مرة جديدة متوسطة النمو تحسنت ومعايرتها (في هذه الحالة لتعديل Dulbecco النسر المتوسط (DMEM) ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)).
- مرة واحدة في المجمعات ترنسفكأيشن والمحتضنة لمدة 15 دقيقة ، ونقل 1.2 مل من وسائل الإعلام إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting ، ونقل على الفور ~ 700 ميكرولتر من المجمعات في كل من بئرين في لوحة 6 - جيدا. إضافة قطرة قطرة ، ومزيج من قبل بلطف يحوم اللوحة. يسمح لخلايا transfect لا يقل عن 3 ساعات (قد تختلف مع نوع من الخلايا).
- إضافة إلى تعقيم تغطية زلات لوحة 6 آبار جديدة. قد تكون مغلفة زلات غطاء لخلية التصاق المحسنة.
- بعد أن الخلايا transfected ، يغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا trysinization الحد الأدنى من خلال إضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر التربسين حل كل جيدا ، وتهييج لفترة وجيزة لوحة لمعطف تماما كل بئر ، والشفط على الفور قبالة التربسين. مرة واحدة رفعت الخلايا ، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام الجديدة.
- عند هذه النقطة ، ينبغي مطلي الخلايا في السكان إما مختلطة أو منفصلة (للضوابط) على زلات تغطية عقيمة.
- يسمح للخلايا لاستعادة لمدة 12 ساعة.
2. خلية الانصهار
- إزالة وسائل الاعلام ثقافة من الخلايا ، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- عند هذه النقطة ، فمن المستحسن لعلاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد (100 ميكروغرام / مل) إلى تثبيط تخليق البروتين. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 2 ساعة ثم يغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- خلايا الصمامات عن طريق تعريضها إلى حل 50 ٪ من البولي ايثيلين جلايكول 1000 (PEG 1000) في المصل خالية DMEM ل 125 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة حل PEG 1000 ، وإضافة 2 مل تحسنت حديثا ووسائل الإعلام معايرتها.
- السماح لاحتضان خلايا لمدة 18 -- 24 ساعة.
مضان المجهر
- إزالة وسائل الإعلام والثقافة ، وغسل خلايا مرتين في برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (في برنامج تلفزيوني) في كل بئر. تستنهض الهمم برفق لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا الثابتة مرتين في برنامج تلفزيوني.
- إزالة الغطاء بعناية زلات من لوحة ، والفتيل قبالة PBS الزائدة. على عكس المجهر الشرائح محملة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة (90 ٪ الجلسرين ، 100mM تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 ، DABCO 2 ٪ (1،4 - diazabicoyclo اوكتان) دابي تحتوي على (4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole).
- إزالة الزائدة متوسطة متزايدة من الشرائح ، وشارك في الختمالنسخة زلات مع طلاء الأظافر.
- تصور هذه الخلايا عن طريق الفحص المجهري أو مبائر epifluorescence.
3. ممثل النتائج
ويبين الشكل 2 تجربة متغايرة النوى سبيل المثال استخدام الخلايا الليفية الأولية وH1299 الرئة خلايا سرطان الخلايا غير الصغيرة. البروتين من الاهتمام في هذه التجربة (دجاج الانيميا الفيروسات VP3) يعرض في المقام الأول في هيولي توطين أنواع الخلايا الأساسية وتوطين النووية في أنواع الخلايا التي تحولت كما تصور المجهري epifluorescence. وأعرب عن هذا البروتين باعتباره إما الانصهار GFP (pEGFP - N1 النواقل ، Clontech) في الخلايا الليفية القلفة الابتدائي (الاتحاد الباكستاني) أو dsRed (dsRed - N1 النواقل ، Clontech) H1299 في الخلايا. عينات التحكم الذاتي التي تنطوي على اندماج (أعلى صفين) عرض خلايا multinucleated مع أي تغيير في أنماط توطين حالة استقرار. مثل هذه التغييرات يمكن أن يحدث خلاف ذلك نظرا لحساسية الظروف الاندماج أو تشكيل syncitia. اندماج متغايرة النوى (الصف السفلي) إثبات دخول النووية من البروتين GFP تنصهر الخلية المستمدة من الابتدائي وcolocalization مع البروتين dsRed تنصهر استجابة لإدخال المواد تتحول الخلية. المثال المعروض هو التحام متغايرة النوى نادرة نسبيا الناجمة عن الخلايا اثنين فقط ، واحدة من كل نوع ، كما يتبين من وجود كل من إشارات fluoroprotein. بالإضافة إلى الكشف عن هذه الأنواع من التحولات التوطين ، ويمكن الكشف عن النواة للنشاط مكوكية بسهولة من خلال وجود fluorophore واحد في كل من النوى. هذا النوع من تقرير واضح عند دراسة اندماج الخلية 1:1 و سيعتمد على تثبيط الترجمة.
الشكل 1. هو استنساخ الرسم البياني للأسلوب متغايرة النوى باستخدام الخلايا الليفية الأولية وسرطان الخلايا H1299 الخلايا غير الصغيرة ، والجين من مصلحة لإنتاج الاندماج في الإطار إلى واحد من اثنين من الجينات بروتين فلوري. ثم يتم خطوط الخلايا transfected عابر مع أي بناء ، وسمحت للتعافي. هو تشكيل المستحث متغايرة النوى عن طريق العلاج قصير مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، يليه حضانة أخرى. أخيرا ، لوحظ تمركز شبه الخلوية من البروتين ذات الاهتمام باستخدام مختلف أشكال المجهر الفلورسنت.
الشكل 2. تصور النواة للهيولى والاتجار مكوكية نشاط البروتين الانيميا الدجاج VP3 الفيروسات التي الانصهار متغايرة النوى. الصف العلوي : صور الممثل الخلايا H1299 الذاتي معربا عن تنصهر dsRed - VP3 الصف الأوسط :.. صور epifluorescence الممثل الأولية الخلايا الليفية القلفة (الاتحاد الباكستاني) معربا عن GFP - VP3 بعد الانصهار PEG الصف السفلي : الانصهار من الاتحاد الباكستاني متغايرة النوى وخلايا H1299. أصفر يشير colocalization من GFP وإشارات dsRed. وكان تصوير الخلايا باستخدام المجهر مضان AF6000E ايكا ايكا وبرامج التصوير.
Discussion
قدمت بروتوكول متغايرة النوى هنا يوفر طريقة فعالة وسهلة التأويل للتوصيف السلوك الخلية توطين نوع معين ، وكذلك النواة للنشاط مكوكية. هذا الأسلوب يستفيد من حساسية التحليل مضان فضلا عن القدرة على الخلايا الحية والصور إجراء دراسات لديناميات البروتين. ويتم تكييف هذه التقنية بسهولة لكثير من أنواع مختلفة من الخلايا ، وهي قابلة لكلا التصوير الخلية الحية والثابتة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المجهر مضان مقلوب لتصوير والتقاط يعيش الفيديو في الوقت الفاصل. على النقيض من ذلك ، يمكن استخدام الخلايا التي تقام في epifluorescence إما المجهري لتحديد حالة استقرار تعريب أو التصوير مبائر أكثر تفصيلا للتعريب ومنفصلة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching (FRAP) ، أو خسارة في مضان photobleaching (FLIP) في تحديد حركية التعريب 1. فإن إدماج fluorophores بديل في البروتوكول يسمح للتجارب التفاعل البروتين مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) التي ستجرى في الحفلة 2. ران مثبطات مختلفة من الاتجار الخلوية مثل B أو الغالبة leptomycin السلبية يمكن استخدامها لإقامة بنيات GTPase الاعتماد على استيراد معين أو مسارات تصدير 5،6،9.
- في التجارب التي تنطوي على بعض النشاط في رحلات مكوكية ، لا بد من توخي الحذر لتجنب آثار التعريب بسبب توليف البروتين الجديد. في هذه الحالات ، يجب استخدام مثبطات الترجمة أو نقطة زمنية محدودة. ومع ذلك ، نظرا لتثبيط التحف متعدية يبقى الاحتمال. ومعظم المطلوب اندماج الخلية التي تحتوي على واحدة من كل نوع من الخلايا لتفسير واضح للتوطين مكوكية والسلوك. قد الأمثل لعدد الخلايا وشروط الاندماج (توقيت وتركيز) قد يكون ضروريا لتعزيز هذا الانصهار 01:01 مواتية الأحداث.
- ومن المهم أن نلاحظ أن الاستفادة المثلى من خطوات معينة في البروتوكول سوف يكون من الضروري تبعا لأنواع معينة تستخدم الخلية. قد الجوانب في الإجراء التجريبي مثل كفاءة الانصهار ، ترنسفكأيشن الكفاءة ، وقدرتها على البقاء بعد انصهار تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الخلايا. على وجه الخصوص ، يمكن أن أنواع الخلايا الأولية أن يكون تحديا لإدارة بسبب الظروف المعقدة والثقافة ترنسفكأيشن الكفاءة المنخفضة. ويمكن استخدام تقنيات مثل الجهاز Nucleofector Lonza سماح للتجهيز السريع للخلايا ، وكذلك الكفاءات ترنسفكأيشن زيادة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، وأساليب electroporation تسمح لسهولة نقل الخلايا في التعليق على الخطوات التي تتبع الانصهار.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر معهد البوليتكنيك ورسستر قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية للحصول على التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
