Summary
Een flexibele en efficiënte methode voor de karakterisering van celtype-specifieke eiwit lokalisatie en nucleocytoplasmic pendelen wordt beschreven. Deze heterokaryon aanpak maakt gebruik van fluorescent gelabelde fusie-eiwitten om de afbeelding eiwit lokalisaties na celfusie. Het protocol vatbaar is voor steady-state lokalisaties of meer dynamische vaststellingen op basis van live-cell imaging.
Abstract
Een groot aantal van de eiwitten worden gereguleerd door subcellulaire handel of nucleocytolasmic shuttling. Deze eiwitten vertonen een divers scala aan cellulaire functies, waaronder nucleaire import / export van RNA en eiwitten, transcriptionele regulatie, en apoptose. Interessant is dat de belangrijkste cellulaire reorganisaties waaronder de celdeling, differentiatie en transformatie, vaak sprake van dergelijke activiteiten 3,4,8,10. De gedetailleerde studie van deze eiwitten en hun regulerende mechanismen kan een uitdaging zijn als de stimulatie van deze lokalisatie veranderingen kunnen worden ongrijpbaar, en de bewegingen zelf kan heel dynamisch en moeilijk op te sporen. Studies met cellulaire oncogenese, bijvoorbeeld, blijven profiteren van het begrijpen van paden en eiwit activiteiten die verschillen tussen normale cellen en primaire getransformeerde cellen 6,7,11,12. As veel eiwitten tonen veranderd lokalisatie tijdens de transformatie of als gevolg van de transformatie, methodes om efficiënt te karakteriseren deze eiwitten en de wegen waaraan zij deelnemen staan om het begrip van oncogenese en open nieuwe gebieden voor drug targeting te verbeteren.
Hier presenteren we een methode voor de analyse van eiwit mensenhandel en pendelt activiteit tussen primaire en omgezette cellen van zoogdieren. Deze methode combineert de generatie van heterokaryon fusies met fluorescentie microscopie een flexibel protocol dat gebruikt kan worden om steady-state-of dynamische eiwit lokalisaties sporen te geven. Zoals weergegeven in figuur 1, zijn twee verschillende celtypen transient getransfecteerd met plasmide constructen met een fluoroprotein gen verbonden aan het gen van belang. Na expressie worden de cellen gefuseerd met behulp van polyethyleenglycol, en eiwit lokalisatie kan dan worden afgebeeld met behulp van verschillende methoden. Het protocol hier wordt gepresenteerd is een fundamentele benadering waarbij gespecialiseerde technieken kunnen worden toegevoegd.
Protocol
1. Transfectie van cellijnen
Transfectie Methode 1
(Lonza Nucleofection voor een grotere primaire cel transfectie-efficiëntie)
- De cellen moeten zijn van de recente passage en in de log-fase voorafgaand aan de groei van transfectie. Was de cellen in fosfaatbuffer gebufferde zoutoplossing (PBS) en oogst cellen door behandeling met trypsine.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 5 minuten.
- Voeg gesteriliseerd dekglaasjes tot een 6-wells plaat. Dekglaasjes kunnen worden bekleed voor een betere celadhesie. Plaats 1,5 ml van de cultuur media (in dit geval Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal bovine serum (FBS)) in elk putje en evenwicht de media in de incubator.
- Oogst de cellen door behandeling met trypsine en resuspendeer in een minimaal volume van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Tel het aantal cellen en centrifuge de juiste hoeveelheid resuspensie tot ~ 5x10 5 cellen per monster.
- Zorgvuldig Resuspendeer de cellen in 100 ul kamertemperatuur Nucleofector oplossing per monster.
- Combineer 100 pi celsuspensie met 5 ug plasmide DNA en breng het monster op een Nucleofector Cuvette zorg dat u luchtbellen bevatten.
- Selecteer de juiste Nucleofector Program (dit kan uit een vorige test nodig hebben om een optimale transfectie-efficiëntie te stellen met minimale mortaliteit).
- Plaats de cuvet met de cel / DNA suspensie in de Nucleofector cuvettehouder en beginnen met het gekozen programma.
- Na voltooiing, verwijder de cuvette en voeg ~ 500 pi van de pre-evenwicht gebracht cultuur media om het (uit de 6-wells plaat).
- Onmiddellijk overdracht het monster in de 6-well plaat met uiteindelijk volume van 1,5 ml per putje. De cellen moeten worden uitgeplaat in een mix van bevolkingsgroepen of afzonderlijk, voor de controles.
Transfectie Methode 2
(Qiagen Effectene transfectie voor cellijnen)
- Bereid transfectie complexen met behulp van de Qiagen Effectene Reagens door eerst toe te voegen 0,8 ug van elk plasmide DNA monster 200 pi EG-buffer.
- Voeg 6,4 ul enhancer reagens aan elk monster, kort mengen door flicking de buis, en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 ui Effectene reagens aan elk monster, meng door flicking de buis, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens deze incubatie, bereiden de twee cellijnen van belang zijn voor transfectie. Was onlangs gepasseerde cellen (<80% confluentie) een keer in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg weer 1,5 mL verse verwarmd en in evenwicht groei medium (in dit geval Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal bovine serum (FBS)).
- Zodra de transfectie complexen hebben geïncubeerd gedurende 15 minuten, overdracht 1,2 ml van media aan elk monster. Meng door pipetteren, en meteen ~ 700 pi van de complexen over te dragen aan elk van de twee putten in de 6-wells plaat. Voeg druppelsgewijs, en meng voorzichtig door werveling van de plaat. Laat cellen om te transfecteren voor minimaal 3 uur (kan variëren met celtype).
- Voeg gesteriliseerd dekglaasjes tot een nieuwe 6-well plaat. Dekglaasjes kunnen worden bekleed voor een betere celadhesie.
- Nadat de cellen zijn getransfecteerd, tweemaal wassen cellen met PBS en oogsten van de cellen door minimale trysinization door het toevoegen van circa 100 ul trypsine oplossing voor elk putje, kort schudden van de plaat om volledig vacht elk putje, en onmiddellijk opzuigen uit de trypsine. Zodra de cellen hebben opgeheven, toe te voegen 1,5 ml vers medium.
- Op dit punt moet cellen worden uitgeplaat in een gemengde of gescheiden populaties (voor de controles) op het steriele dekglaasjes.
- Laat cellen te herstellen gedurende 12 uur.
2. Celfusie
- Verwijder de cultuur media uit de cellen en was tweemaal met PBS.
- Op dit punt, is het aanbevolen om de cellen met cycloheximide (100 ug / mL) te trakteren op eiwitsynthese te remmen. Laat de cellen om incubeer gedurende 2 uur en vervolgens twee keer was de cellen met PBS.
- Zekering cellen door ze bloot te stellen aan een oplossing van 50% polyethyleenglycol 1000 (PEG 1000) in serum-vrij DMEM voor 125 seconden bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met PBS om de PEG 1000 oplossing te verwijderen, en 2 ml vers verwarmd en in evenwicht media toe te voegen.
- Laat cellen om incuberen voor 18 - 24 uur.
Fluorescentiemicroscopie
- Verwijder de cultuur media, en twee keer was de cellen in PBS.
- Fix-cellen door het toevoegen van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud voorzichtig gedurende 15 minuten.
- Was de vaste cellen twee keer in PBS.
- Voorzichtig de dekglaasjes te verwijderen van de plaat, lont overtollige PBS. Omkeren op objectglaasjes geladen met een druppel van de montage medium (90% glycerol, 100mm Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-octaan) met DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole).
- Verwijder overtollige montage medium van de dia's, en afdichting cover glijdt met nagellak.
- Visualiseer de cellen via confocale microscopie of epifluorescentie.
3. Representatieve resultaten
Figuur 2 toont een voorbeeld heterokaryon experiment met behulp van primaire fibroblasten en H1299 niet-kleincellig longcarcinoom cellen. Het eiwit van belang in dit experiment (kippen anemia virus-VP3) toont in de eerste plaats cytoplasmatische lokalisatie in de primaire celtypen en de nucleaire lokalisatie in getransformeerde celtypes zoals gevisualiseerd door epifluorescentie microscopie. Het eiwit wordt uitgedrukt als een fusie van beide GFP (pEGFP-N1 vector, Clontech) in primaire voorhuid fibroblasten (PFF) of DsRed (DsRed-N1 vector, Clontech) in de H1299-cellen. Controlemonsters met betrekking tot self-fusies (bovenste twee rijen) weer te geven meerkernige cellen met geen verandering in steady-state lokalisatie patronen. Dergelijke veranderingen zouden anders voordoen als gevolg van gevoeligheid voor fusie voorwaarden of de vorming van syncitia. Heterokaryon fusies (onderste rij) aan te tonen nucleaire ingang van de GFP-gefuseerde primaire cel afkomstige eiwitten en colocalization met de DsRed-gefuseerde eiwit in reactie op de introductie van de getransformeerde cel materiaal. Het getoonde voorbeeld is een relatief zeldzame heterokaryon fusie als gevolg van slechts twee cellen, een van elk type, zoals blijkt uit de aanwezigheid van beide fluoroprotein signalen. In aanvulling op het opsporen van deze vormen van lokalisatie overgangen, kan nucleocytoplasmic pendelen activiteit gemakkelijk worden gedetecteerd door de aanwezigheid van een fluorofoor in beide kernen. Dit type van de bepaling is duidelijk bij de behandeling van 01:01 cel fusies en zou afhangen van de remming van de vertaling.
Figuur 1. Stroomschema van de heterokaryon methode met primaire fibroblasten en H1299 niet-kleincellig longcarcinoom cellen. Gen van belang is gekloond om een in-frame fusie produceren om een van de twee fluorescerende proteïne genen. Cellijnen zijn dan transient getransfecteerd met de aanleg en liet zich te herstellen. Heterokaryon vorming wordt veroorzaakt door korte behandeling met polyethyleenglycol (PEG), gevolgd door verdere incubatie. Ten slotte wordt de sub-cellulaire lokalisatie van het eiwit van belang waargenomen met behulp van verschillende vormen van fluorescentie microscopie.
Figuur 2. Nucleocytoplasmic mensenhandel en shuttling activiteit van de kippen anemia virus VP3 eiwit gevisualiseerd door heterokaryon fusie. Bovenste rij: Representatieve beelden van zelf-gefuseerde H1299 cellen die DsRed-VP3 Middelste rij:.. Representatieve epifluorescentie beelden van primaire voorhuid fibroblast cellen (PFF) uitdrukken GFP-VP3 na PEG fusion Onderste rij: Heterokaryon fusie van PFF en H1299-cellen. Geel geeft colocalization van GFP en DsRed signalen. Cellen werden afgebeeld met behulp van een Leica AF6000E fluorescentie microscoop en Leica imaging software.
Discussion
De hier gepresenteerde heterokaryon protocol biedt een efficiënte en eenvoudig interpreteerbaar methode voor de karakterisering van celtype-specifieke lokalisatie gedrag en nucleocytoplasmic shuttling activiteit. Deze methode maakt gebruik van de gevoeligheid van fluorescentie analyse, alsmede de mogelijkheid om beeld levende cellen en het uitvoeren van studies van eiwitten dynamiek. De techniek is eenvoudig aan te passen voor veel verschillende celtypes en vatbaar is voor zowel live als vaste cell imaging. Zo kan bijvoorbeeld omgekeerde fluorescentie microscopie gebruikt worden voor live beeldvorming en time lapse video vast te leggen. Daarentegen kan gemonteerd cellen worden gebruikt in een van beide epifluorescentie microscopie voor de bepaling van de steady-state lokalisaties of meer gedetailleerde confocale beeldvorming van discrete lokalisaties. Bovendien kunnen technieken, zoals fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP), of fluorescentie verlies in fotobleken (FLIP) worden gebruikt in de bepaling van de lokalisatie kinetiek 1. De integratie van alternatieve fluoroforen in het protocol mogelijk zou maken eiwit interactie experimenten zoals fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) uit te voeren in concert 2. Verschillende remmers van cellulaire mensenhandel, zoals leptomycin B of dominant negatieve Ran GTPase constructen kunnen worden gebruikt om de afhankelijkheid van bepaalde importeren of exporteren paden 5,6,9 vast te stellen.
- In bepaalde experimenten met pendelen activiteit, moet erop worden gelet dat lokalisatie effecten als gevolg van de synthese van nieuwe eiwitten te voorkomen. In deze gevallen moet vertaling remmers of beperkte tijdstippen worden gebruikt. Echter, artefacten te wijten aan translationeel remming blijft een mogelijkheid. Cel fusies met een van elk celtype zijn het meest gewenst zijn voor duidelijke interpretatie van shuttling en lokalisatie gedrag. Optimalisatie van het aantal cellen en fusie voorwaarden (timing en concentratie) kan nodig zijn om een dergelijke gunstige 1:01 fusie evenementen te promoten.
- Het is belangrijk op te merken dat het optimaliseren van bepaalde stappen in het protocol noodzakelijk zijn, afhankelijk van de specifieke gebruikte cel types. Aspecten in de experimentele procedure, zoals fusie-efficiëntie, transfectie-efficiëntie, en de levensvatbaarheid na fusie kan sterk variëren tussen celtypen. In het bijzonder, kunnen primaire celtypen een uitdaging te beheren als gevolg van complexe kweekomstandigheden en lage transfectie efficiëntie. Het gebruik van technologieën zoals de Lonza Nucleofector apparaat kan zorgen voor een snelle verwerking van de cellen en sterk toegenomen transfectie efficiëntie. Bovendien, elektroporatie methoden zorgen voor een gemakkelijke overdracht van cellen in suspensie tot de fusie stappen die volgen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag het Worcester Polytechnic Institute departement chemie en biochemie bedanken voor financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
