Summary
Une méthode souple et efficace pour la caractérisation de la localisation de protéines cellulaires spécifiques au type et à la navette nucléocytoplasmique est décrite. Cette approche utilise les protéines de fusion hétérocaryon marqués à la fluorescence d'localisations protéines image après la fusion cellulaire. Le protocole se prête à l'état stationnaire localisations ou plusieurs déterminations dynamique basée sur l'imagerie de cellules vivantes.
Abstract
Un nombre important de protéines sont réglementés par le trafic subcellulaire ou nucleocytolasmic navette. Ces protéines afficher un large éventail de fonctions cellulaires, y compris l'import nucléaire / export des ARN et des protéines, la régulation transcriptionnelle, et l'apoptose. Fait intéressant, grandes réorganisations cellulaires, y compris la division cellulaire, la différenciation et la transformation, impliquent souvent des activités telles 3,4,8,10. L'étude détaillée de ces protéines et leurs mécanismes de régulation peut être difficile car la stimulation de ces changements de localisation peut être insaisissable, et les mouvements eux-mêmes peuvent être très dynamiques et difficiles à suivre. Les études portant sur l'oncogenèse cellulaire, par exemple, continuent de bénéficier de voies de compréhension et d'activités de protéines qui diffèrent entre les cellules normales primaires et les cellules transformées 6,7,11,12. Comme de nombreuses protéines montrent la localisation altérée durant la transformation ou à la suite de la transformation, des méthodes pour caractériser ces protéines efficacement et les voies à laquelle ils participent debout pour améliorer la compréhension de l'oncogenèse et ouvrir de nouveaux domaines pour le ciblage de médicaments.
Nous présentons ici une méthode pour l'analyse du trafic des protéines et l'activité navettes entre le primaire et des cellules transformées de mammifères. Cette méthode combine la génération de fusions hétérocaryon par microscopie à fluorescence de fournir un protocole flexible qui peut être utilisé pour détecter les localisations des protéines état stable ou dynamique. Comme le montre la figure 1, deux types cellulaires distincts sont transitoirement transfectées avec des constructions plasmidiques portant un gène fluoroprotéiniques attaché au gène d'intérêt. Après l'expression, les cellules sont fusionnées à l'aide de polyéthylène glycol, et des localisations de protéines peuvent ensuite être visualisés en utilisant une variété de méthodes. Le protocole présenté ici est une approche fondamentale à laquelle les techniques spécialisées peuvent être ajoutés.
Protocol
1. Transfection de lignées cellulaires
Une méthode de transfection
(Nucléofection Lonza pour une efficacité accrue de cellules primaires de transfection)
- Les cellules doivent être de passage récent et en phase exponentielle de croissance avant la transfection. Laver les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et la récolte des cellules par trypsinisation.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 1500 xg pendant 5 minutes.
- Ajouter lamelles stérilisés à une plaque de 6 puits. Lamelles peuvent être revêtus d'adhésion cellulaire améliorée. Placer 1,5 ml de milieux de culture (dans ce cas moyennes Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum fœtal bovin (FBS)) dans chaque puits et équilibrer les médias dans l'incubateur.
- Récolter les cellules par trypsinisation et remettre en suspension dans un volume minimal de tampon phosphate salin (PBS).
- Compter les cellules et centrifuger la quantité correcte de la remise en suspension de fournir ~ 5x10 5 cellules par échantillon.
- Resuspendre les cellules attentivement dans 100 uL solution de salle de Nucleofector température par exemple.
- Combinez 100 uL de suspension cellulaire avec 5 ug d'ADN plasmidique et le transfert de l'échantillon dans une cuvette Nucleofector en faisant attention de ne pas inclure de bulles d'air.
- Sélectionnez le programme approprié Nucleofector (cela peut nécessiter des tests précédents pour établir l'efficacité de transfection optimale avec une mortalité minimale).
- Insérez la cuvette contenant la suspension cellulaire / ADN dans le support de cuvette Nucleofector et commencer le programme sélectionné.
- Une fois terminée, retirez la cuvette et ajouter ~ 500 ul de milieu de culture pré-équilibrée à elle (sur la plaque de 6 puits).
- Immédiatement transférer l'échantillon dans la plaque de 6 puits avec un volume final de 1,5 ml par puits. Les cellules doivent être plaqués dans les deux populations mixtes ou séparément, pour les contrôles.
2 méthode de transfection
(Qiagen Effectene transfection de lignées cellulaires)
- Préparer les complexes de transfection avec le réactif Qiagen Effectene en ajoutant d'abord 0,8 mg de chaque échantillon d'ADN plasmidique à 200 pi de tampon CE.
- Ajouter 6,4 uL de réactif Enhancer pour chaque échantillon, mélanger brièvement en feuilletant le tube et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
- Ajouter 20 uL Effectene réactif à chaque échantillon, mélanger en feuilletant le tube et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
- Pendant cette incubation, préparer les deux lignées de cellules d'intérêt pour la transfection. Laver les cellules récemment repiquées (confluent <80%) une fois dans un tampon phosphate salin (PBS). Rajouter 1,5 ml de milieu frais de croissance réchauffé et équilibrée (dans ce cas de Dulbecco modifié Eagle (DMEM), 10% de sérum fœtal bovin (FBS)).
- Une fois les complexes de transfection ont incubé pendant 15 minutes, transférer 1,2 ml de milieu à chaque échantillon. Mélanger à la pipette et transférer immédiatement ~ 700 uL des complexes à chacun des deux puits dans la plaque de 6 puits. Ajouter goutte à goutte, et mélanger en douceur en faisant tournoyer la plaque. Laisser les cellules à transfecter pendant au moins 3 heures (peut varier selon le type cellulaire).
- Ajouter lamelles stérilisés à une nouvelle plaque de 6 puits. Lamelles peuvent être revêtus d'adhésion cellulaire améliorée.
- Après que les cellules transfectées ont, laver les cellules deux fois avec du PBS et la récolte des cellules par trysinization minimale en ajoutant environ 100 uL solution de trypsine dans chaque puits, agiter brièvement la plaque pour bien enrober chaque bien, et immédiatement aspiration hors de la trypsine. Une fois les cellules ont levé, ajouter 1,5 ml de milieu frais.
- À ce stade, les cellules doivent être plaqués au sein des populations mixtes ou séparées (pour les contrôles) sur les lamelles stériles.
- Laisser les cellules de récupérer pendant 12 heures.
2. Fusion cellulaire
- Retirez le support de culture des cellules et laver deux fois avec du PBS.
- À ce stade, il est recommandé de traiter les cellules avec du cycloheximide (100 pg / ml) pour inhiber la synthèse protéique. Laisser les cellules à incuber pendant 2 heures puis laver les cellules deux fois avec du PBS.
- Fusible cellules en les exposant à une solution de 50% de polyéthylène glycol 1000 (PEG 1000) dans du DMEM sans sérum pour 125 secondes à température ambiante.
- Laver les cellules avec du PBS pour éliminer la solution de PEG 1000, et ajouter 2 ml fraîchement réchauffé et les médias équilibrée.
- Laisser les cellules à incuber pendant 18 - 24 heures.
Microscopie par fluorescence
- Retirez le support de culture, et laver les cellules deux fois dans du PBS.
- Fixer les cellules en ajoutant 1 ml d'une solution de paraformaldéhyde 4% (dans du PBS) à chaque puits. Agiter doucement pendant 15 minutes.
- Laver les cellules deux fois en PBS fixes.
- Retirez délicatement les lamelles de la plaque, mèche l'excès de PBS. Inverser sur lames de microscope chargé avec une goutte de milieu de montage (90% de glycérol, 100mm Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-octane) contenant du DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole).
- Enlever l'excès de milieu de montage des lames, et sceller la coopérationVer glisse avec des vernis à ongles.
- Visualisez les cellules par microscopie confocale ou à épifluorescence.
3. Les résultats représentatifs
La figure 2 montre une expérience hétérocaryon exemple en utilisant des fibroblastes primaires et H1299 non à petites cellules de poumon de cellules cancéreuses. La protéine d'intérêt dans cette expérience (anémie poulet Virus-VP3) affiche la localisation cytoplasmique surtout dans les types de cellules primaires et de localisation nucléaire dans des types cellulaires transformées comme visualisé par microscopie à épifluorescence. La protéine est exprimée comme une fusion soit la GFP (pEGFP-N1 vecteur, Clontech) dans des fibroblastes de prépuce primaires (PFF) ou DsRed (DsRed-N1 vecteur, Clontech) dans les cellules H1299. Les échantillons de contrôle impliquant l'auto-fusions (les deux premiers rangs) l'affichage des cellules multinucléées, sans changement dans les modes de localisation état stable. De tels changements pourraient autrement se produire en raison de la sensibilité aux conditions de fusion ou de la formation de syncitia. Fusions hétérocaryon (rangée du bas) démontrent d'entrée nucléaire de la GFP fusionné primaires de cellules dérivées de protéines et de colocalisation avec la protéine DsRed fusionnés en réponse à l'introduction de matériel cellulaire transformé. L'exemple montré est une fusion hétérocaryon relativement rare résultant de seulement deux cellules, une de chaque type, comme en témoigne la présence de deux signaux fluoroprotéiniques. En plus de détecter les types de transitions de localisation, de l'activité navette nucléocytoplasmique peut être facilement détecté par la présence d'un fluorophore unique en deux noyaux. Ce type de détermination est claire lorsqu'on examine 01:01 fusions de cellules et dépendra de l'inhibition de la traduction.
Figure 1. Organigramme de la méthode utilisant hétérocaryon fibroblastes primaires et H1299 non à petites cellules de carcinome cellulaire. Le gène d'intérêt est cloné pour produire une fusion en phase l'un des deux gènes de protéines fluorescentes. Les lignées cellulaires sont ensuite transfectées transitoirement avec soit de construire et permis de récupérer. La formation hétérocaryon est induite par un bref traitement avec du polyéthylène glycol (PEG) suivie d'une incubation supplémentaire. Enfin, la localisation sub-cellulaire de la protéine d'intérêt est observé en utilisant diverses formes de microscopie à fluorescence.
Figure 2. Le trafic nucléocytoplasmique et la navette d'activité de l'anémie poulet Virus VP3 protéines visualisées par fusion hétérocaryon. Rangée du haut: les images représentant des auto-H1299 fusionné des cellules exprimant DsRed-VP3 Rangée du milieu:.. Représentant images épifluorescence de cellules primaires de fibroblastes du prépuce (PFF) exprimant la GFP-VP3 après fusion PEG Rangée du bas: la fusion des hétérocaryon PFF et H1299 cellules. Le jaune indique colocalisation de la GFP et les signaux DsRed. Les cellules ont été imagées par un Leica AF6000E fluorescence microscope et un logiciel d'imagerie Leica.
Discussion
Le protocole présenté ici fournit hétérocaryon une méthode efficace et facilement interprétables pour la caractérisation du comportement localisation cellulaire de type spécifique ainsi que l'activité navette nucléocytoplasmique. Cette méthode tire parti de la sensibilité de l'analyse par fluorescence ainsi que la capacité de cellules de l'image en direct et effectuer des études sur la dynamique des protéines. La technique est facilement adaptable pour de nombreux types cellulaires différents et se prête à la fois imagerie des cellules vivantes et fixées. Par exemple, la microscopie à fluorescence inversé peut être utilisé pour l'imagerie en direct et de capture vidéo laps de temps. En revanche, les cellules montées peuvent être utilisés soit en microscopie à épifluorescence pour la détermination de l'état stable localisations ou plus détaillée d'imagerie confocale de localisations discrètes. Par ailleurs, des techniques telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), ou la perte de fluorescence dans le photoblanchiment (FLIP) peut être utilisé dans la détermination des cinétiques une localisation. L'incorporation de fluorophores de remplacement dans le protocole permettrait à des expériences d'interactions protéiques comme le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) à être menées de concert 2. Différents inhibiteurs de la traite cellulaires tels que B leptomycin ou dominant négatif Ran GTPase des constructions peuvent être utilisées pour établir la dépendance sur les importations ou les voies d'exportation notamment 5,6,9.
- Dans certaines expériences impliquant la navette activité, des précautions doivent être prises pour éviter les effets de localisation due à la synthèse de nouvelles protéines. Dans ces cas, les inhibiteurs de la traduction ou des points de temps limitée doit être utilisée. Cependant, les artefacts dus à l'inhibition traductionnelle rester une possibilité. Fusions de cellules contenant un de chaque type de cellule sont plus désirés pour l'interprétation claire de la navette et le comportement de localisation. Optimisation du nombre de cellules et les conditions de la fusion (timing et de concentration) peuvent être nécessaires pour promouvoir ces événements de fusion favorables 01h01.
- Il est important de noter que l'optimisation de certaines étapes dans le protocole seront nécessaires selon les types de cellules particulières utilisées. Aspects de la procédure expérimentale de fusion tels que l'efficacité, efficacité de la transfection et la viabilité après fusion peut varier considérablement entre les différents types cellulaires. En particulier, les types de cellules primaires peuvent être difficiles à gérer en raison de conditions de culture complexe et des efficacités de transfection faible. L'utilisation de technologies telles que le périphérique Lonza Nucleofector peut permettre un traitement rapide des cellules ainsi que des efficacités de transfection considérablement augmenté. En outre, les méthodes électroporation permet le transfert facile des cellules en suspension pour les étapes de fusion qui suivent.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier l'Institut polytechnique de Worcester Département de chimie et biochimie de financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
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