Summary
सेल प्रकार के विशेष प्रोटीन स्थानीयकरण और nucleocytoplasmic चक्कर के लक्षण वर्णन के लिए एक लचीला और कुशल पद्धति में वर्णित है. यह heterokaryon दृष्टिकोण सेल संलयन के बाद छवि प्रोटीन localizations fluorescently लेबल संलयन प्रोटीन का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल स्थिर राज्य localizations या अधिक गतिशील रहते सेल इमेजिंग के आधार पर निर्धारण के लिए उत्तरदायी है.
Abstract
प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण संख्या subcellular तस्करी या चक्कर nucleocytolasmic द्वारा विनियमित रहे हैं. ये प्रोटीन आरएनए और प्रोटीन के परमाणु आयात / निर्यात, transcriptional विनियमन, और apoptosis सहित सेलुलर कार्यों की एक विविध सरणी प्रदर्शित करते हैं. दिलचस्प है, कोशिका विभाजन, भेदभाव और परिवर्तन सहित प्रमुख सेलुलर reorganizations, अक्सर ऐसी गतिविधियों 3,4,8,10 शामिल है . इन प्रोटीन और उनके संबंधित नियामक तंत्र के विस्तृत अध्ययन इन स्थानीयकरण मायावी जा सकता है परिवर्तन के लिए, उत्तेजना, और खुद को काफी गतिशील और मुश्किल ट्रैक किया जा सकता है आंदोलनों के रूप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सेलुलर अध्ययन शामिल oncogenesis, उदाहरण के लिए, समझ रास्ते और प्रोटीन गतिविधियों है कि सामान्य प्राथमिक कोशिकाओं और बदल 6,7,11,12 कोशिकाओं के बीच अलग से लाभ के लिए जारी है. कई प्रोटीन के रूप में परिवर्तन के दौरान या परिवर्तन का एक परिणाम के के रूप में बदल स्थानीयकरण, कुशलता इन प्रोटीनों विशेषताएँ तरीके और रास्ते में जो वे oncogenesis और दवा लक्ष्यीकरण के लिए खुले नए क्षेत्रों की समझ में सुधार करने के लिए खड़े भाग लेने दिखा.
यहाँ हम प्रोटीन की तस्करी के विश्लेषण के लिए एक तरीका मौजूद है और प्राथमिक और बदल स्तनधारी कोशिकाओं के बीच चक्कर गतिविधि. इस विधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ heterokaryon fusions की पीढ़ी के लिए एक लचीला प्रोटोकॉल है कि स्थिर राज्य या गतिशील प्रोटीन localizations का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करने को जोड़ती है. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, दो अलग सेल प्रकार transiently प्लाज्मिड constructs एक fluoroprotein हित के जीन से जुड़ी जीन के असर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. अभिव्यक्ति के बाद, कोशिकाओं polyethylene glycol का उपयोग में जुड़े हुए हैं, और प्रोटीन localizations तो तरीकों की एक किस्म का उपयोग imaged किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मौलिक दृष्टिकोण है जो विशेष तकनीक जोड़ा जा सकता है.
Protocol
1. सेल लाइन्स के अभिकर्मक
अभिकर्मक विधि 1
(बढ़ प्राथमिक कोशिका अभिकर्मक दक्षता के लिए Lonza Nucleofection)
- कक्ष ही में पारित होने के और लॉग चरण अभिकर्मक के लिए पहले विकास में होना चाहिए. Phophate में कोशिकाओं को धो खारा (PBS) और फसल की कोशिकाओं द्वारा trypsinization buffered.
- 5 मिनट के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
- 6 अच्छी तरह से एक थाली कवर फिसल जाता है निष्फल जोड़ें. कवर फिसल जाता है बढ़ाया कोशिका आसंजन के लिए लेपित किया जा सकता है. प्लेस 1.5 संस्कृति मीडिया के एमएल (इस मामले में Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM मध्यम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) और एक कुएं में इनक्यूबेटर में मीडिया को संतुलित करना.
- और फॉस्फेट का एक न्यूनतम मात्रा में trypsinization resuspend द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट खारा buffered (पीबीएस).
- कोशिकाओं की गणना और resuspension की सही मात्रा ~ नमूना प्रति 5x10 5 कोशिकाओं प्रदान अपकेंद्रित्र.
- 100 μL नमूना प्रति कमरे के तापमान Nucleofector समाधान में कोशिकाओं ध्यान से Resuspend.
- 5 μg प्लास्मिड डीएनए के साथ सेल निलंबन के 100 μL का मिश्रण है और एक Nucleofector सावधान किया जा रहा क्युवेट हवाई बुलबुले शामिल नहीं करने के लिए नमूना हस्तांतरण.
- उपयुक्त Nucleofector कार्यक्रम (यह पिछले परीक्षण की आवश्यकता के लिए कम से कम मृत्यु दर के साथ इष्टतम अभिकर्मक दक्षता की स्थापना कर सकते हैं) का चयन करें.
- Nucleofector क्युवेट धारक में निलंबन / कोशिका के डीएनए युक्त क्युवेट डालें और चयनित कार्यक्रम शुरू.
- पूरा होने पर, क्युवेट हटाने और यह (6 अच्छी तरह से थाली से लिया) ~ पूर्व equilibrated संस्कृति मीडिया के 500 μL जोड़ने.
- तुरंत 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 1.5 एमएल की अंतिम मात्रा के साथ नमूना हस्तांतरण. कक्ष या तो मिश्रित या अलग आबादी में चढ़ाया जाना चाहिए नियंत्रण के लिए.
अभिकर्मक विधि 2
(Qiagen सेल लाइनों के लिए Effectene अभिकर्मक)
- अभिकर्मक Qiagen Effectene अभिकर्मक का उपयोग परिसरों पहले 200 μL चुनाव आयोग बफर करने के लिए प्रत्येक प्लास्मिड डीएनए नमूने के 0.8 μg जोड़कर तैयार करें.
- प्रत्येक नमूने के लिए 6.4 μL बढ़ाने अभिकर्मक जोड़ें, ट्यूब flicking द्वारा संक्षिप्त मिश्रण है, और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं.
- ट्यूब flicking द्वारा 20 μL Effectene अभिकर्मक प्रत्येक नमूने, मिश्रण, जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- इस ऊष्मायन के दौरान, अभिकर्मक के लिए ब्याज की दो सेल लाइनों को तैयार करते हैं. फॉस्फेट में एक बार धो हाल ही में passaged कोशिकाओं (संगम <80%) खारा (पीबीएस) buffered. वापस 1.5 एमएल ताजा गरम और equilibrated विकास मध्यम जोड़ें (इस मामले में Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)).
- एक बार अभिकर्मक परिसरों 15 मिनट के लिए incubated है, प्रत्येक नमूना के लिए मीडिया के 1.2 एमएल हस्तांतरण. Pipetting, और तुरंत 6 अच्छी तरह से थाली में दो कुओं में से प्रत्येक के लिए ~ 700 μL परिसरों के हस्तांतरण द्वारा मिक्स. Dropwise जोड़ें, और धीरे थाली घूमता द्वारा मिश्रण. कोशिकाओं को कम से कम 3 घंटे के लिए transfect करने के लिए अनुमति दें (सेल प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं).
- एक नया 6 अच्छी तरह से थाली निष्फल कवर फिसल जाता है जोड़ें. कवर फिसल जाता है बढ़ाया कोशिका आसंजन के लिए लेपित किया जा सकता है.
- बाद कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट है, कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार और प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 100 μL trypsin समाधान जोड़ने, संक्षेप में पूरी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से कोट करने के लिए थाली आंदोलन, और तुरंत बंद trypsin aspirating न्यूनतम trysinization द्वारा कोशिकाओं फसल धोने. एक बार कोशिकाओं को उठाया है, 1.5 एमएल ताजा मीडिया जोड़ें.
- इस बिंदु पर, कोशिकाओं बाँझ कवर फिसल जाता है पर या तो मिश्रित या अलग आबादी नियंत्रण के लिए () में चढ़ाया जाना चाहिए.
- कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें.
2. सेल फ्यूजन
- कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोने.
- इस बिंदु पर, यह cycloheximide (100 μg / एमएल) के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करने की सिफारिश की है. कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए सेते हैं और फिर कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोने की अनुमति दें.
- 50% सीरम मुक्त DMEM में polyethylene glycol 1000 (1000 खूंटी) के एक समाधान के लिए उन्हें कमरे के तापमान पर 125 सेकंड के लिए उजागर द्वारा फ्यूज कोशिकाओं.
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं धो खूंटी 1000 समाधान निकालने के लिए, और 2 एमएल हौसले गरम और equilibrated मीडिया जोड़ें.
- 24 घंटे कोशिकाओं - 18 के लिए सेते दें.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- संस्कृति मीडिया निकालें, और कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धोने.
- एक 4% paraformaldehyde प्रत्येक अच्छी तरह से हल (पीबीएस में) के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें. 15 मिनट के लिए धीरे आंदोलन.
- तय कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धोएं.
- ध्यान थाली से कवर फिसल जाता है को दूर करने के लिए, अतिरिक्त पीबीएस बंद बाती. खुर्दबीन स्लाइड बढ़ते मध्यम (90% ग्लिसरॉल, 100mm Tris पीएच 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo ओकटाइन) युक्त DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) की एक बूंद के साथ भरी हुई है. पर उलटें
- स्लाइड्स से अधिक बढ़ते मध्यम निकालें, और सील सहदेखें नेल पॉलिश के साथ निकल जाता है.
- Confocal या epifluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं कल्पना.
3. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 एक उदाहरण heterokaryon प्राथमिक fibroblasts और H1299 गैर छोटे सेल फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर प्रयोग से पता चलता है. इस प्रयोग में ब्याज की प्रोटीन (चिकन एनीमिया वायरस - VP3) epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में प्राथमिक कोशिका प्रकार में मुख्य रूप से cytoplasmic स्थानीयकरण और तब्दील प्रकार की कोशिकाओं में परमाणु स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है. प्रोटीन या तो GFP के लिए एक प्राथमिक चमड़ी (PFF) fibroblasts या dsRed में (वेक्टर pEGFP-N1, Clontech) संलयन H1299 कोशिकाओं में (dsRed N1 वेक्टर, Clontech) के रूप में व्यक्त किया है. नियंत्रण स्वयं fusions को शामिल नमूने (शीर्ष दो पंक्तियाँ) स्थिर राज्य स्थानीयकरण पैटर्न में कोई परिवर्तन नहीं के साथ multinucleated कोशिकाओं को प्रदर्शित करते हैं. इस तरह के बदलाव अन्यथा संलयन शर्तों या syncitia के गठन के लिए संवेदनशीलता के कारण हो सकता है. Heterokaryon fusions (नीचे पंक्ति) GFP जुड़े प्राथमिक प्रोटीन सेल व्युत्पन्न और dsRed इनकार तब्दील सेल सामग्री के परिचय के जवाब में प्रोटीन के साथ colocalization के परमाणु प्रविष्टि प्रदर्शित. दिखाए गए उदाहरण में एक अपेक्षाकृत दुर्लभ heterokaryon केवल दो कोशिकाओं, प्रत्येक प्रकार के, के रूप में दोनों fluoroprotein संकेतों की उपस्थिति से प्रदर्शन से उत्पन्न संलयन है. स्थानीयकरण संक्रमण के इन प्रकार का पता लगाने के अलावा, nucleocytoplasmic चक्कर गतिविधि दोनों नाभिक में एक की fluorophore उपस्थिति द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है. दृढ़ संकल्प के इस प्रकार स्पष्ट है जब 1:01 सेल fusions जांच और अनुवाद के निषेध पर निर्भर करेगा.
चित्रा 1. Heterokaryon प्राथमिक fibroblasts और H1299 गैर छोटे सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर विधि का फ्लो चार्ट ब्याज की जीन दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के लिए एक फ्रेम में संलयन का उत्पादन करने के लिए क्लोन है. सेल लाइनों तो transiently या तो निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और ठीक करने के लिए अनुमति दी. Heterokaryon गठन आगे ऊष्मायन के बाद polyethylene glycol (खूंटी) के साथ संक्षिप्त उपचार से प्रेरित है. अंत में, ब्याज की प्रोटीन के उप सेलुलर स्थानीयकरण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के विभिन्न रूपों का उपयोग करने के लिए मनाया जाता है.
चित्रा 2. Nucleocytoplasmic तस्करी और चिकन एनीमिया वायरस VP3 प्रोटीन की गतिविधि चक्कर heterokaryon संलयन द्वारा visualized. शीर्ष पंक्ति: स्वयं इनकार H1299 dsRed VP3 व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिनिधि मध्य पंक्ति छवियों: प्राथमिक चमड़ी fibroblast कोशिकाओं (PFF) खूंटी संलयन के बाद GFP-VP3 व्यक्त की प्रतिनिधि epifluorescence छवियों नीचे पंक्ति: PFF और H1299 कोशिकाओं के Heterokaryon संलयन. पीला GFP और dsRed संकेतों के colocalization इंगित करता है. कक्ष एक Leica AF6000E प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और Leica इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग imaged थे.
Discussion
heterokaryon प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत सेल स्थानीयकरण प्रकार विशिष्ट रूप में अच्छी तरह के रूप में nucleocytoplasmic चक्कर गतिविधि व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है. इस विधि प्रतिदीप्ति विश्लेषण की संवेदनशीलता के रूप में अच्छी तरह के रूप में की क्षमता छवि जीवित कोशिकाओं के लिए और प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करते हैं का लाभ लेता है. तकनीक को आसानी से कई अलग अलग सेल प्रकार के लिए अनुकूल है और दोनों रहते हैं और निश्चित सेल इमेजिंग के लिए उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रहते इमेजिंग और समय व्यतीत हो वीडियो पर कब्जा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत करके, घुड़सवार कोशिकाओं स्थिर राज्य localizations या अधिक विस्तृत असतत localizations के confocal इमेजिंग के निर्धारण के लिए या तो epifluorescence माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (FRAP), या photobleaching में प्रतिदीप्ति हानि (फ्लिप) के रूप में इस तरह की तकनीक स्थानीयकरण 1 कैनेटीक्स के निर्धारण में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल में वैकल्पिक fluorophores का समावेश प्रोटीन बातचीत प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा (झल्लाहट) हस्तांतरण के लिए 2 संगीत कार्यक्रम में आयोजित किया जा के रूप में ऐसे प्रयोगों के लिए अनुमति होगी. जैसे leptomycin बी या नकारात्मक प्रमुख सेलुलर तस्करी के विभिन्न inhibitors दौड़ा GTPase constructs के लिए विशेष आयात या निर्यात रास्ते 5,6,9 पर निर्भरता की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कुछ गतिविधि के चक्कर शामिल प्रयोगों में, देखभाल स्थानीयकरण नए प्रोटीन के संश्लेषण के लिए कारण प्रभाव से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इन मामलों में, अनुवाद inhibitors या सीमित समय के अंक का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हालांकि, translational निषेध के कारण कलाकृतियों को एक संभावना रहते हैं. सेल प्रत्येक कोशिका प्रकार युक्त fusions चक्कर और स्थानीयकरण व्यवहार की स्पष्ट व्याख्या के लिए सबसे वांछित हैं. सेल नंबर और शर्तों संलयन (समय और एकाग्रता) के अनुकूलन ऐसी अनुकूल 01:01 संलयन घटनाओं को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल में कुछ कदम के अनुकूलन के विशेष सेल इस्तेमाल किया प्रकार के आधार पर आवश्यक हो जाएगा नोट. संलयन दक्षता, अभिकर्मक दक्षता, और संलयन के बाद व्यवहार्यता जैसे प्रयोगात्मक प्रक्रिया में पहलुओं बहुत सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं. विशेष रूप में, प्राथमिक कोशिका प्रकार के जटिल संस्कृति शर्तों और कम अभिकर्मक क्षमता के कारण प्रबंधन चुनौतीपूर्ण हो सकता है. Lonza Nucleofector डिवाइस के रूप में इस तरह की तकनीकों का उपयोग कोशिकाओं का तेजी से प्रसंस्करण के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई अभिकर्मक क्षमता की अनुमति कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, electroporation तरीकों निलंबन में कक्षों की आसान संलयन चरणों का पालन करने के लिए स्थानांतरण के लिए अनुमति देते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Worcester पॉलिटेक्निक संस्थान रसायन विज्ञान और जैव रसायन के विभाग के लिए धन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
