Summary
Un método flexible y eficiente para la caracterización de la localización de la proteína tipo de células específicas y nucleocytoplasmic ir y venir se describe. Este enfoque heterocarión utiliza fluorescencia marcado con proteínas de fusión a la proteína localizaciones imagen después de la fusión celular. El protocolo es susceptible de estado estacionario localizaciones o más determinaciones dinámicas basadas en imágenes de células vivas.
Abstract
Un número importante de proteínas están regulados por el tráfico subcelular o nucleocytolasmic yendo y viniendo. Estas proteínas muestran una gran variedad de funciones celulares, incluyendo la importación nuclear / exportación de ARN y proteínas, la regulación transcripcional y apoptosis. Curiosamente, los grandes reorganizaciones celulares, incluyendo la división celular, la diferenciación y la transformación, a menudo involucran actividades como 3,4,8,10. El estudio detallado de estas proteínas y sus mecanismos de regulación respectiva puede ser un reto como el estímulo para la localización de estos cambios puede ser difícil de alcanzar, y los movimientos se puede ser muy dinámico y difícil de rastrear. Los estudios que incluyen la oncogénesis celular, por ejemplo, seguir beneficiándose de las vías de entendimiento y las actividades de las proteínas que difieren entre las células normales de primaria y las células transformadas 6,7,11,12. De proteínas que muestran la localización alterado durante la transformación o como resultado de la transformación, los métodos para caracterizar de manera eficiente estas proteínas y las vías en las que participan de pie para mejorar la comprensión de la oncogénesis y abrir nuevas áreas de fármaco que se dirige.
Aquí presentamos un método para el análisis de tráfico de proteínas y yendo y viniendo entre la actividad de las células de mamíferos primarios y transformados. Este método combina la generación de fusiones heterocarión con microscopía de fluorescencia para proporcionar un protocolo flexible que puede ser utilizado para detectar la proteína localizaciones en estado estable o dinámica. Como se muestra en la Figura 1, dos tipos de células separadas se transfectadas transitoriamente con las construcciones de plásmido lleva un gen fluoroproteínicos unido al gen de interés. Después de la expresión, las células se fusionan con glicol de polietileno, y localizaciones de la proteína se puede obtener imágenes con una variedad de métodos. El protocolo que aquí se presenta es un enfoque fundamental de las técnicas especializadas se pueden añadir.
Protocol
1. Transfección de líneas celulares
Transfección Método 1
(Nucleofection Lonza para una mayor eficiencia de la transfección de células primarias)
- Las células deben ser de reciente aprobación y registro en el crecimiento de la fase previa de la transfección. Lavar las células de fosfato (PBS) y las células de la cosecha por tripsinización.
- Recoger las células por centrifugación a 1500 xg durante 5 minutos.
- Añadir esterilizados cubreobjetos en una placa de 6 pocillos. Cubreobjetos se pueden revestir para la adhesión celular mejorada. Coloque 1,5 ml de medio de cultivo (en este caso la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 10% de suero fetal bovino (SFB)) en cada pocillo y equilibrar los medios de comunicación en la incubadora.
- Recoger las células por tripsinización y resuspender en un volumen mínimo de tampón fosfato salino (PBS).
- Contar las células y centrifugar la cantidad correcta de la resuspensión de proporcionar ~ 5x10 5 células por muestra.
- Resuspender las células con cuidado en una solución de 100 Nucleofector sala de l temperatura por muestra.
- Combine 100 L de suspensión de células con el ADN del plásmido 5 mg y la transferencia de la muestra a una cubeta Nucleofector teniendo cuidado de no incluir burbujas de aire.
- Seleccione el programa adecuado Nucleofector (esto puede requerir pruebas previas para establecer la eficiencia de transfección óptima con un mínimo de mortalidad).
- Inserte la cubeta con la suspensión de células / ADN en el soporte de la cubeta Nucleofector e iniciar el programa seleccionado.
- Al terminar, retire la cubeta y añadir ~ 500 l de medio de cultivo pre-equilibrio a la misma (en la placa de 6 pocillos).
- Inmediatamente la transferencia de la muestra en la placa de 6 pocillos con un volumen final de 1,5 ml por pocillo. Las células deben ser plateado, ya sea en poblaciones mixtas o por separado, para los controles.
Transfección Método 2
(Qiagen Effectene transfección de líneas celulares)
- Preparar complejos de transfección usando el reactivo de Qiagen Effectene agregando primero 0,8 g de cada muestra de ADN del plásmido a 200 l buffer CE.
- Añadir 6,4 l de reactivo potenciador de cada muestra, mezclar brevemente por prender el tubo, y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 20 l de reactivo Effectene a cada muestra, mezclar agitando el tubo, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Durante la incubación, preparar las dos líneas celulares de interés para la transfección. Lavar las células recientemente pasajes (<80% de confluencia) una vez en tampón fosfato salino (PBS). Añadir 1,5 ml de nuevo medio de cultivo fresco caliente y equilibrada (en este caso la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 10% de suero fetal bovino (SFB)).
- Una vez que los complejos de transfección se incubaron durante 15 minutos, la transferencia de 1,2 ml de los medios de comunicación a cada muestra. Mezclar con la pipeta, y de inmediato la transferencia de unos 700 l de los complejos de cada uno de los dos pozos en la placa de 6 pocillos. Añadir gota a gota, y mezclar suavemente haciendo girar el plato. Permiten a las células a transfectar por lo menos 3 horas (puede variar según el tipo de células).
- Añadir esterilizados cubreobjetos a una nueva de 6 pocillos. Cubreobjetos se pueden revestir para la adhesión celular mejorada.
- Después de que las células se transfectaron, lavar las células dos veces con PBS y la cosecha de las células por trysinization mínimo mediante la adición de aproximadamente 100 l de solución de tripsina a cada pocillo, agitar brevemente la placa a plena capa cada pozo, y de inmediato la aspiración de la tripsina. Una vez que las células se han levantado, añadir 1,5 ml de medio fresco.
- En este punto, las células se sembraron en la población, ya sea mezclado o por separado (para controles) en el cubreobjetos estériles.
- Permiten a las células para recuperarse durante 12 horas.
2. La fusión de células
- Eliminar los medios de cultivo de las células y lavar dos veces con PBS.
- En este punto, se recomienda para tratar las células con cicloheximida (100 mg / mL) para inhibir la síntesis de proteínas. Permitir que las células se incuba durante 2 horas y luego se lavan las células dos veces con PBS.
- Células se fusionan mediante la exposición a una solución de polietileno de 50% de 1000 glicol (PEG 1000) en el suero libre de DMEM durante 125 segundos a temperatura ambiente.
- Lavar las células con PBS para eliminar la solución de PEG 1000, y agregar 2 ml recién calentado y los medios de comunicación equilibrada.
- Permitir que las células se incuba durante 18 a 24 horas.
Microscopía de fluorescencia
- Eliminar los medios de cultivo, y lavar las células dos veces en PBS.
- Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 minutos.
- Lavar las células dos veces en PBS fija.
- Retire con cuidado el cubreobjetos de la placa, la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos cargados con una gota de medio de montaje (90% de glicerol, 100 mM Tris pH 7,5, el 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo octanaje) con DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole).
- Retire el exceso de medio de montaje de las diapositivas, y co sellover hojas con esmalte de uñas.
- Visualizar las células a través de microscopía confocal o epifluorescencia.
3. Resultados representante
La figura 2 muestra un experimento heterocarión ejemplo, con los fibroblastos primarios y H1299 células no pequeñas de pulmón de células cancerosas. La proteína de interés en este experimento (pollo Anemia Virus-VP3) muestra la localización citoplasmática principalmente en tipos de células primarias y la localización nuclear de tipos de células transformadas como se visualiza mediante microscopía de epifluorescencia. La proteína se expresa como una fusión de cualquiera de las buenas prácticas agrarias (pEGFP-N1 vector, Clontech) en fibroblastos de prepucio primaria (FPF) o dsRed (dsRed-N1 vector, Clontech) en las células H1299. Muestras de control de la participación auto-fusión (dos filas superiores) muestran células multinucleadas sin ningún cambio en los patrones de localización de estado estacionario. Estos cambios de lo contrario podría ocurrir debido a la sensibilidad a las condiciones de la fusión o la formación de sincitios. Fusiones heterocarión (fila inferior), demuestran la entrada nuclear de la GFP-fundido primario de células derivadas de proteínas y colocalización con la proteína dsRed fusionado en respuesta a la introducción de material de células transformadas. El ejemplo que se muestra es una fusión heterocarión relativamente raras como resultado de sólo dos células, una de cada tipo, como lo demuestra la presencia de ambas señales fluoroproteínicos. Además de detectar este tipo de transiciones de localización, actividad nucleocytoplasmic ir y venir puede ser fácilmente detectado por la presencia de un solo fluoróforo en ambos núcleos. Este tipo de determinación es clara al examinar 01:01 fusiones celulares y que dependen de la inhibición de la traducción.
Figura 1. Diagrama de flujo del método heterocarión con fibroblastos primarios y H1299 no pequeñas células de carcinoma de células. El gen de interés es clonado para producir una fusión en el marco de uno de los dos genes de proteínas fluorescentes. Líneas celulares se transfectadas transitoriamente, ya sea con la construcción y les permitió recuperar. Heterocarión formación es inducida por el tratamiento breve con polietilenglicol (PEG), seguido de la incubación. Por último, la localización subcelular de la proteína de interés se observa mediante diversas formas de microscopía de fluorescencia.
Figura 2. El tráfico de ir y venir nucleocytoplasmic y la actividad de la proteína del virus de la Anemia de pollo VP3 visualizado por la fusión heterocarión. Fila superior: Imágenes representativas de la auto-fusionado H1299 células que expresan dsRed-VP3 Fila central:.. Representante imágenes de epifluorescencia de células primarias de fibroblastos de prepucio (PFF) que expresan GFP-VP3 después de la fusión PEG Fila inferior: fusión heterocarión de la FPF y las células H1299. El color amarillo indica colocalización de las buenas prácticas agrarias y las señales de dsRed. Las células fueron fotografiadas con un microscopio de fluorescencia Leica AF6000E y el software Leica imágenes.
Discussion
El protocolo heterocarión que aquí se presenta ofrece un método eficaz y fácilmente interpretable para la caracterización del comportamiento de la localización de células de tipo específico, así como la actividad nucleocytoplasmic yendo y viniendo. Este método se aprovecha de la sensibilidad de los análisis de fluorescencia, así como la capacidad de las células de la imagen en vivo y la realización de estudios de la dinámica de las proteínas. La técnica se adapta fácilmente a diferentes tipos de células y es susceptible de dos imágenes de células vivas y fijos. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia invertido se puede utilizar para imágenes en vivo y captura de lapso de tiempo de vídeo. Por el contrario, las células de montaje puede ser utilizado tanto en la microscopía de epifluorescencia para la determinación del estado de equilibrio o de imagen confocal localizaciones más detallada de localizaciones discretas. Por otra parte, las técnicas como la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP), o la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) se puede utilizar en la determinación de la cinética de una localización. La incorporación de fluoróforos se alternan en el protocolo permitiría a los experimentos de interacción de proteínas como la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) que se realizará en dos conciertos. Diferentes inhibidores de la trata de celulares, tales como B leptomycin o dominante negativo construye GTPasa Ran se puede utilizar para establecer la dependencia de la importación particular o vías de exportación 5,6,9.
- En algunos experimentos implican ir y venir de actividad, se debe tener cuidado para evitar los efectos de localización debido a la síntesis de nuevas proteínas. En estos casos, los inhibidores de la traducción o puntos de tiempo limitado se debe utilizar. Sin embargo, los artefactos debido a la inhibición de la traducción sigue siendo una posibilidad. Fusiones de células que contienen uno de cada tipo de células son los más deseados para una interpretación clara de ir y venir y el comportamiento de la localización. Optimización del número de células y las condiciones de la fusión (de tiempo y concentración) puede ser necesario para promover estos eventos favorables fusión 01:01.
- Es importante tener en cuenta que la optimización de ciertas medidas en el protocolo, será necesario en función de los tipos de células utilizadas. Aspectos en el procedimiento experimental como la eficiencia de fusión, la eficiencia de transfección y viabilidad después de la fusión puede variar mucho entre los distintos tipos de células. En particular, los principales tipos de células pueden ser difíciles de manejar debido a las condiciones de cultivo complejos y bajas eficiencias de transfección. El uso de tecnologías tales como el dispositivo de Lonza Nucleofector puede permitir el procesamiento rápido de las células, así como aumentado dramáticamente la eficiencia de transfección. Además, los métodos de electroporación permite una fácil transferencia de células en suspensión a los pasos que siguen a la fusión.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Instituto Politécnico de Worcester Departamento de Química y Bioquímica de la financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
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