Summary
Mekik hücre tipine spesifik protein yerelleştirme ve Nükleositoplazmik karakterizasyonu için esnek ve verimli bir yöntem açıklanmıştır. Bu heterokaryon yaklaşım görüntü protein lokalizasyonu hücre füzyonu sonra floresan etiketli füzyon proteinleri kullanır. Protokol kararlı durum lokalizasyonu veya canlı hücre görüntüleme dayalı daha dinamik tespitler mükellef.
Abstract
Önemli bir sayıda proteinler, hücre içi ticareti veya nucleocytolasmic mekik tarafından düzenlenir. Bu proteinler, RNA ve protein nükleer ithalat / ihracat, transkripsiyonal yönetmelik, ve apoptosis gibi hücresel fonksiyonları çeşitli bir dizi gösterir. İlginçtir, hücre bölünmesi, farklılaşma ve dönüşüm de dahil olmak üzere önemli hücresel yeniden yapılanma, sık sık bu tür faaliyetler 3,4,8,10 içerir. Bu proteinlerin ve kendi düzenleyici mekanizmaların detaylı bir çalışma bu lokalizasyon değişiklikleri zor olabilir uyarılması ve kendilerini izlemek için oldukça dinamik ve zor olabilir hareketleri gibi zor olabilir. Hücresel karsinojeneze içeren çalışmalar, örneğin, anlayış yollar ve birincil, normal hücreleri ve transforme hücreleri 6,7,11,12 arasında farklılık protein aktiviteleri yararlanmaya devam. Birçok protein değişmiş dönüşümü sırasında veya lokalizasyonu, dönüşümün bir sonucu olarak verimli bir şekilde bu proteinlerin karakterize etmek için yöntemler ve ilaç hedef karsinojeneze ve açık yeni alanlar anlayışı geliştirmek stand katıldığı yollar gösterir.
Burada protein ticareti analizi için bir yöntem mevcut ve birincil ve transforme memeli hücreleri arasındaki aktivite mekik. Bu yöntem, kararlı durum ya da dinamik protein lokalizasyonu tespit etmek için kullanılan esnek bir protokol sağlamak için floresan mikroskobu ile heterokaryon füzyonlar nesil birleştirir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, iki ayrı hücre tipleri geçici ilgi gen bağlı bir Fluoroprotein geni taşıyan plazmid yapıları ile transfekte. Ifade sonra, hücreler polietilen glikol kullanarak erimiş ve protein lokalizasyonu daha sonra çeşitli yöntemler kullanarak görüntülü olabilir. Burada sunulan protokol, özel teknikler ilave edilebilir temel bir yaklaşımdır.
Protocol
1. Hücre Hatları, Transfeksiyon
Transfeksiyon Yöntem 1
(Lonza, artan primer hücre transfeksiyon verimlilik için Nucleofection)
- Hücreler son geçiş ve önce transfeksiyon log fazı büyüme olmalıdır. Fosfat içinde hücreler yıkayın trypsinization tamponlu salin (PBS) ve hasat hücreleri.
- 1500 xg'de 5 dakika santrifüj hücreleri toplayın.
- 6 plaka sterilize kapak fişleri ekleyin. Kapak fişleri gelişmiş hücre adezyon kaplı olabilir. Yeri 1.5 ml kültür ortamı (bu durumda Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS)) ve her kuyuya inkübatör ortam dengelenmesi.
- Fosfat minimal volüm trypsinization ve tekrar süspansiyon hücreleri tarafından Hasat tamponlu salin (PBS).
- Hücre sayımı ve tabanda örnek başına ~ 5x10 5 hücre sağlamak için doğru miktarda santrifüj.
- Numune başına 100 mcL oda sıcaklığında Nucleofector çözüm hücreleri dikkatli bir şekilde tekrar
- 5 mg plazmid DNA ile birleştirin ve hücre süspansiyonu 100 mcL Nucleofector Küvet hava kabarcıkları dahil etmek için dikkatli bir örnek aktarmak.
- Uygun Nucleofector Programı (minimal mortalite ile optimal transfeksiyon etkinliğini kurmak için önceki testi gerekebilir) seçin.
- Nucleofector Küvet Tutucu hücre / DNA süspansiyon içeren küvet takın ve seçilen program başlar.
- Tamamlanmasının ardından, küvet kaldırmak ve (6 plaka alınan) ~ 500 mcL ön dengelenmiş kültür ortamı ekleyin.
- Hemen yanı başına 1.5 mL son hacmi ile 6-plaka içine örnek aktarmak. Hücreler kontrolleri için, karma nüfuslu ya da ayrı ayrı ya kaplama olmalıdır.
Transfeksiyon Yöntemi 2
(Qiagen Effectene transfeksiyon hücre hatları için)
- Her plazmid DNA örneği 0.8 mg 200 mcL EC tampon ekleyerek ilk Qiagen Effectene Reaktif transfeksiyon kompleksleri kullanarak hazırlayın.
- Her numune için 6.4 mcL arttırıcı reaktif, tüp Flicking kısaca karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
- Tüp Flicking tarafından her örnek, mix 20 mcL Effectene reaktif ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Bu kuluçka sırasında, transfeksiyon için ilgi iki hücre hatları hazırlamak. Son geçişli hücreler (<% 80 izdiham) yıkayın kez fosfat tamponlu salin (PBS). 1.5 ml taze ısıtılmış ve dengelenir büyüme orta Ekle (Bu durumda Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS)).
- 15 dakika boyunca inkübe transfeksiyon kompleksleri sonra, her bir örnek 1.2 mL medya aktarın. Pipetleme, ve 6-plaka hemen her iki kuyu için yaklaşık 700 mcL kompleksleri transferi ile karıştırın. Damla damla ekleyin ve plaka dönen hafifçe karıştırın. Hücrelerin en az 3 saat transfect için izin ver (hücre tipi ile değişiklik gösterebilir).
- Sterilize kapak fişleri yeni bir 6-plaka ekleyin. Kapak fişleri gelişmiş hücre adezyon kaplı olabilir.
- Hücrelerin transfekte sonra, her bir kuyunun yaklaşık 100 mcL tripsin çözüm ekleyerek, kısaca her bir kuyunun tam kat plaka ajitasyon ve hemen tripsin aspire PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve minimal trysinization hücreleri tarafından hasat. Hücreleri kaldırdı sonra, 1.5 mL taze medya ekleyin.
- Bu noktada, hücrelerin steril bir örtü fişleri üzerine karışık veya ayrı olarak nüfus (kontrol) kaplama olmalıdır.
- Hücreler 12 saat kurtarmak için izin verin.
2. Hücre Fusion
- Hücrelerin kültür ortamları çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın.
- Bu noktada, protein sentezini inhibe sikloheksimid (100 mg / ml) ile hücrelerin tedavisi için tavsiye edilir. Hücreler 2 saat süreyle inkübe ve sonra hücreler PBS ile iki kez yıkamak için izin verin.
- 125 saniye boyunca oda sıcaklığında serum serbest DMEM% 50 polietilen glikol 1000 (PEG 1000) bir çözüm onları teşhir ederek Sigorta hücreleri.
- PEG 1000 çözüm kaldırmak ve 2 ml taze ısıtılmış ve dengelenir medya eklemek hücreleri PBS ile yıkayın.
- Hücreleri için 18 - 24 saat inkübe için izin verin.
Floresan Mikroskopi
- Kültür ortamı çıkarın ve hücreler PBS içinde iki kez yıkayın.
- Her iyi bir% 4 paraformaldehid solüsyonu (PBS) 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak. 15 dakika boyunca yavaşça ajitasyon.
- Sabit hücreler PBS içinde iki kez yıkayın.
- Plaka kapağını dikkatlice fişleri kaldırmak, aşırı PBS kapalı fitil. Üzerine mikroskop yüklenen montaj orta (% 90 gliserol, 100 mM Tris, pH 7.5,% 2 DABCO (1,4-diazabicoyclo oktanlı) içeren DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) ile bir damla slaytlar. Haricindekileri
- Slaytları fazla montaj orta çıkarın ve mühür cooje ile ver sığar.
- Konfokal veya Epifloresans mikroskobu ile hücre gözünüzde canlandırın.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 2 birincil fibroblastlar ve H1299 küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücreleri kullanarak bir örnek heterokaryon deney gösterir. Bu deneyde ilgi protein (Tavuk Anemisi Virüs VP3) Epifloresans mikroskopi tarafından görüntülenmiştir olarak öncelikle birincil hücre tipleri sitoplazmik yerelleştirme ve transforme hücre tipleri nükleer lokalizasyon gösterir. Protein H1299 hücrelerinde birincil sünnet derisi fibroblastlar (PFF) veya dsRed GFP ya da bir füzyon (pEGFP N1 vektör, Clontech) (dsRed-N1 vektörü, Clontech) olarak ifade edilir. Kendi füzyonlar içeren kontrol numuneleri (üst iki satır), kararlı durum lokalizasyon desen hiçbir değişiklik multinükleer hücreler gösterir. Bu tür değişiklikler aksi füzyon koşulları veya syncitia oluşumu hassasiyeti nedeniyle meydana gelebilir. Heterokaryon füzyonlar (alt sıra) nükleer GFP-erimiş birincil hücre kaynaklı protein ve transforme hücre malzeme giriş yanıt dsRed erimiş protein ile ko giriş göstermektedir. Gösterilen örnek, hem Fluoroprotein sinyallerin varlığını gösterdiği gibi, sadece iki hücre, her tür, oldukça nadir görülen bir heterokaryon füzyon. Nükleositoplazmik mekik faaliyet yerelleştirme geçişler bu tür tespit ek olarak, hem de çekirdeklerin tek bir fluorofor varlığı kolayca tespit edilebilir. Bu tip tayini 01:01 hücre füzyonlar incelenmesi ve çeviri inhibisyonuna bağlı olacaktır açıktır.
Şekil 1. Heterokaryon yöntemin birincil fibroblastlar ve H1299 küçük hücreli dışı karsinom hücreleri kullanarak akış şeması ilgi gen iki floresan protein genleri tek bir kare füzyon üretmek için klonlanmış. Daha sonra hücre hatları geçici ya da inşa transfekte ve kurtarmak için izin vardır. Heterokaryon oluşumu daha fazla inkübasyon polietilen glikol (PEG) ile kısa süreli tedavi ile meydana gelir. Son olarak, faiz protein alt hücresel yerleşimi floresan mikroskobu çeşitli formları kullanarak görülmektedir.
Şekil 2. Nükleositoplazmik kaçakçılığı ve Tavuk Anemisi Virüs VP3 proteinin aktivitesi mekik heterokaryon füzyon tarafından görüntülendi. Üst satır: dsRed-VP3 ifade kendinden erimiş H1299 hücreleri Temsilcisi Orta sıra: PEG füzyon sonra GFP-VP3 ifade birincil sünnet derisi fibroblast hücreleri (PFF) Temsilcisi Epifloresans görüntüleri Alt satır: PFF ve H1299 hücreleri Heterokaryon füzyon. Sarı GFP ve dsRed sinyaller ko gösterir. Hücreler bir Leica AF6000E floresan mikroskop ve Leica görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülenmiştir.
Discussion
Burada sunulan heterokaryon protokol hücre tipine spesifik lokalizasyon davranış yanı sıra Nükleositoplazmik mekik faaliyet karakterizasyonu için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, floresan analizi duyarlılık yanı sıra yetenek görüntü canlı hücreleri ve protein dinamiği çalışmaları gerçekleştirmek yararlanır. Tekniği, pek çok farklı hücre tipleri için kolayca adapte ve hem canlı ve sabit hücre görüntüleme için uygun. Örneğin, ters floresan mikroskopi canlı görüntüleme ve zaman atlamalı video yakalama için kullanılabilir. Buna karşılık, kararlı durum lokalizasyonu veya ayrık lokalizasyonları daha ayrıntılı konfokal görüntüleme belirlenmesi için iki Epifloresans mikroskopi monte hücreleri kullanılıyor olabilir. Ayrıca, bu tür photobleaching sonra floresan kurtarma (sıkı bağlamak), ya da floresan photobleaching içinde kaybı (FLIP) gibi teknikler, lokalizasyon kinetiği 1 tespitinde kullanılabilir . Protokol alternatif fluorophores birleşme 2 konser yapılacak floresan rezonans enerji transferi (FRET) gibi protein etkileşim deneyler için izin verecek. Leptomycin B veya olumsuz egemen olarak hücresel ticareti Çeşitli inhibitörleri Ran GTPaz yapıları, özellikle ithalat veya ihracat yollar 5,6,9 bağımlılığı kurmak için kullanılabilir .
- Faaliyet mekik içeren bazı deneylerde, bakım, yeni protein sentezi nedeniyle yerelleştirme etkilerinden kaçınmak için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu durumlarda, çeviri inhibitörleri veya sınırlı bir süre noktaları kullanılmalıdır. Ancak, bir olasılık translasyonel inhibisyonu nedeniyle eserler kalır. Biri Hücre füzyonlar her hücre tipi içeren, mekik ve yerelleştirme davranışı net yorumlanması için en çok istenen. Hücre sayısı ve füzyon koşulları (zamanlama ve konsantrasyon) optimizasyonu tür olumlu 01:01 füzyon olayları teşvik etmek için gerekli olabilir.
- Protokol bazı adımlar bu optimizasyon kullanılan özel hücre tipleri bağlı olarak gerekli olacaktır dikkat etmek önemlidir. Füzyon etkinlik, Transfeksiyonu verimlilik ve füzyon sonra canlılığını deneysel işlemin Yönleri hücre tipleri arasında büyük farklılık gösterebilir. Özellikle, birincil hücre tiplerinin karmaşık kültür koşulları ve düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle yönetmek için zor olabilir. Lonza Nucleofector cihazı gibi teknolojileri kullanımı hücrelerin hızlı bir şekilde işleme yanı sıra önemli ölçüde artmıştır transfeksiyon verimliliği izin verebilirsiniz. Ayrıca, elektroporasyon yöntemleri takip füzyon adımları askıya hücre kolay transferi için izin verir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Worcester Politeknik Enstitüsü Bölümü Kimya ve Biyokimya finansman için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
