Summary
Eine flexible und effiziente Verfahren zur Charakterisierung von Zelltyp-spezifische Protein-Lokalisierung und nukleozytoplasmatischen pendelt beschrieben. Dieser Ansatz nutzt heterokaryon fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen Bild Protein Lokalisierungen nach Zellfusion. Das Protokoll ist offen für Steady-State-Lokalisierungen oder mehrere dynamische Bestimmungen auf Live Cell Imaging basiert.
Abstract
Eine beträchtliche Anzahl von Proteinen durch subzelluläre Menschenhandel oder nucleocytolasmic pendelt geregelt. Diese Proteine zeigen eine Vielfalt von zellulären Funktionen, einschließlich nuklearer Import / Export von RNA und Protein, Regulation der Transkription und Apoptose. Interessanterweise wichtigen zellulären Reorganisationen einschließlich Zellteilung, Differenzierung und Transformation, oft mit solchen Aktivitäten 3,4,8,10. Die detaillierte Untersuchung dieser Proteine und ihre jeweiligen Regulationsmechanismen kann als Anregung für diese Lokalisierung Veränderungen können schwer zu fassen, und die Bewegungen selbst recht dynamisch und schwer zu verfolgen, kann eine Herausforderung. Studien mit zellulären Onkogenese, zum Beispiel weiterhin von Verständnis Wege-und Protein-Aktivitäten, die zwischen normalen primären Zellen und transformierten Zellen 6,7,11,12 unterscheiden profitieren. Da viele Proteine zeigen veränderte Lokalisation während der Transformation oder als Ergebnis der Transformation, Methoden zur effizienten Charakterisierung dieser Proteine und die Wege, in denen sie sich beteiligen, stehen für das Verständnis der Onkogenese und neue Bereiche für Drug Targeting zu verbessern.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Analyse von Protein-Handel und pendelt Aktivität zwischen Primär-und transformierter Säugetierzellen. Diese Methode kombiniert die Erzeugung von heterokaryon Fusionen mit Fluoreszenzmikroskopie zu einem flexiblen Protokoll, mit dem steady-state oder dynamischen Protein-Lokalisierungen erkennen werden können. Wie in Abbildung 1 gezeigt, sind zwei getrennte Zelltypen transient mit Plasmid-Konstrukte die mit einem Fluorprotein Gens an das Gen von Interesse transfiziert. Nach Expression werden die Zellen verschmolzen unter Verwendung von Polyethylenglykol, und Protein-Lokalisation kann dann aufgenommen mit einer Vielzahl von Methoden. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein grundlegendes Konzept, um die speziellen Techniken hinzugefügt werden kann.
Protocol
1. Transfektion von Zelllinien
Transfektion Methode 1
(Lonza Nucleofection für erhöhte primäre Zelle Transfektionseffizienz)
- Die Zellen sind von den letzten Durchgang und in der log-Phase Wachstum vor der Transfektion werden. Wash-Zellen in phophate Kochsalzlösung (PBS) und Ernte-Zellen durch Trypsinierung.
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 5 Minuten.
- Add sterilisiert Deckgläser mit einem 6-Well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden. Legen Sie 1,5 ml Kulturmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)) in jede Vertiefung und Gleichgewicht der Medien in den Inkubator.
- Ernte der Zellen durch Trypsinierung und resuspendieren in einem minimalen Volumen von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Zählen Sie die Zellen und Zentrifuge die richtige Menge der Resuspension auf ~ 5x10 5 Zellen pro Probe zu erhalten.
- Resuspendieren der Zellen vorsichtig in 100 ul Raumtemperatur Nucleofector Lösung pro Probe.
- Kombinieren Sie 100 ul Zellsuspension mit 5 ug Plasmid-DNA und übertragen Sie die Probe auf eine Nucleofector Cuvette man aufpassen, nicht, um Luftblasen enthalten.
- Wählen Sie das entsprechende Nucleofector Program (dies kann eine frühere Prüfung erforderlich, um eine optimale Transfektionseffizienz mit minimaler Mortalität zu etablieren).
- Legen Sie die Küvette mit der Zelle / DNA-Suspension in den Nucleofector Küvettenhalter und beginnen das ausgewählte Programm.
- Nach der Fertigstellung, entfernen Sie die Küvette und fügen ~ 500 ul der voräquilibriert Kulturmedien, um es (aus dem 6-Well-Platte).
- Unmittelbar Übertragung der Probe in die 6-well-Platte mit Endvolumen von 1,5 ml pro Vertiefung. Die Zellen sind entweder in gemischten Populationen oder separat beschichtet werden, für die Kontrollen.
Transfektion Methode 2
(Qiagen Effectene Transfektion für die Zell-Linien)
- Bereiten Transfektionskomplexe mit dem Qiagen Effectene Reagenz, indem man zunächst 0,8 ug jedes Plasmid-DNA-Probe zu 200 ul EC-Puffer.
- Add 6,4 ul-Enhancer-Reagenz zu jeder Probe, kurz mischen Dazu den Schlauch, und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
- Add 20 uL Effectene Reagenz zu jeder Probe, mischen durch flicking das Rohr, und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Während dieser Inkubation, bereiten sich die beiden Zelllinien von Interesse für die Transfektion. Wash kürzlich passagiert Zellen (<80% Konfluenz) einmal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie wieder 1,5 ml frisch aufgewärmt und äquilibriert Wachstumsmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)).
- Nach der Transfektion Komplexe für 15 Minuten inkubiert, Übertragung 1,2 ml Medium zu jeder Probe. Mix durch Pipettieren und sofort in die ~ 700 ul der Komplexe zu jedem der beiden Brunnen in der 6-Well-Platte. Fügen Sie tropfenweise zugeben und durch sanft durch Schwenken der Platte. Lassen Zellen für mindestens 3 Stunden transfizieren (kann mit Zelltyp variieren).
- Add sterilisiert Deckgläser, um eine neue 6-well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden.
- Nachdem die Zellen transfiziert wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Ernte der Zellen durch minimale trysinization durch Zugabe von ca. 100 ul Trypsin-Lösung in jede Vertiefung, kurz Schütteln der Platte voll Fell jede Vertiefung, und sofort Absaugen der Trypsin. Sobald die Zellen angehoben haben, fügen Sie 1,5 ml frisches Medium.
- An diesem Punkt sollten die Zellen entweder in gemischten oder getrennten Populationen (für Kontrollen) auf die sterile Deckgläser plattiert werden.
- Lassen Zellen für 12 Stunden zu erholen.
2. Zellverschmelzung
- Entfernen Kulturmedien aus den Zellen und waschen zweimal mit PBS.
- An dieser Stelle empfiehlt es sich, die Zellen mit Cycloheximid (100 ug / mL) zu behandeln, um die Proteinsynthese zu hemmen. Lassen Sie die Zellen für 2 Stunden inkubiert und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
- Fuse-Zellen indem sie zu einer Lösung von 50% Polyethylenglykol 1000 (PEG 1000) in serumfreiem DMEM für 125 Sekunden bei Raumtemperatur.
- Wash-Zellen mit PBS, die PEG 1000-Lösung zu entfernen, und fügen Sie 2 mL frisch aufgewärmt und äquilibriert Medien.
- Lassen Zellen für 18 inkubieren - 24 Stunden.
Fluoreszenz-Mikroskopie
- Entfernen Sie den Kulturmedien, und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS.
- Fix-Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Vorsichtig für 15 Minuten rühren.
- Waschen Sie die fixierten Zellen zweimal in PBS.
- Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser von der Platte, überschüssiges PBS Docht. Invert auf Objektträger geladen mit einem Tropfen Eindeckmedium (90% Glycerin, 100 mM Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-Oktan) mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindole).
- Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium vom Rutschen und Dichtung cover rutscht mit Nagellack.
- Visualisieren Sie die Zellen über konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie.
3. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt ein Beispiel heterokaryon Experiment mit primären Fibroblasten und H1299 nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom-Zellen. Das Protein von Interesse in diesem Experiment (Chicken Anämie Virus-VP3) zeigt in erster Linie zytoplasmatische Lokalisation im primären Zelltypen und nukleare Lokalisation in transformierten Zelltypen wie visualisiert Epifluoreszenzmikroskopie. Das Protein wird als Fusionsprotein entweder GFP (pEGFP-N1-Vektor, Clontech) in primären Vorhaut-Fibroblasten (PFF) oder dsRed (dsRed-N1-Vektor, Clontech) in H1299-Zellen exprimiert. Kontrollproben mit Selbst-Fusionen (obere zwei Zeilen) angezeigt mehrkernige Zellen ohne Veränderung der Steady-State-Lokalisierungs-Muster. Solche Veränderungen könnten sonst entstehen durch Sensibilität für Fusion Bedingungen oder die Bildung von Syncytien. Heterokaryon Fusionen (untere Reihe) zeigen nuklearen Eingabe der GFP-fusionierten primäre cell-derived Protein und Kolokalisation mit dem dsRed-Fusionsprotein in Reaktion auf die Einführung von transformierten Zellmaterial. Das gezeigte Beispiel ist eine relativ seltene heterokaryon Fusion aus nur zwei Zellen, eine von jeder Art, wie durch die Anwesenheit der beiden Fluorprotein Signale gezeigt. Neben der Erkennung dieser Art von Lokalisierungs-Übergänge, kann nukleozytoplasmatischen pendelt Aktivität leicht durch die Anwesenheit eines einzigen Fluorophor in beide Kerne erkannt werden. Dieser Typ der Bestimmung ist klar, bei der Prüfung 01.01 Zelle Fusionen und würde auf der Hemmung der Translation abhängig.
Abbildung 1. Ablaufschema der heterokaryon Methode unter Verwendung von primären Fibroblasten und H1299 non-small cell carcinoma-Zellen. Das Gen von Interesse ist geklont, um eine in-frame Fusion zu einem von zwei fluoreszierende Protein-Gene zu erzeugen. Zelllinien werden dann vorübergehend mit entweder Konstrukt transfiziert und erlaubte sich zu erholen. Heterokaryon Bildung wird durch eine kurze Behandlung mit Polyethylenglykol (PEG) durch weitere Inkubation induziert. Schließlich ist die sub-zelluläre Lokalisation des Proteins von Interesse beobachtet mit verschiedenen Formen der Fluoreszenz-Mikroskopie.
Abbildung 2. Nukleozytoplasmatischen Menschenhandel und pendelt Aktivität der Hühner Anämie Virus VP3 Protein visualisiert heterokaryon Fusion. Obere Reihe: Repräsentative Bilder selbst verschmolzen H1299 Zellen, dsRed-VP3 Mittlere Reihe:.. Vertreter Epifluoreszenz Bilder von primären Vorhaut-Fibroblasten-Zellen (PFF), die GFP-VP3 nach PEG Fusion Untere Reihe: Heterokaryon Fusion von PFF und H1299 Zellen. Gelb bedeutet Kolokalisation von GFP und DsRed-Signale. Die Zellen wurden aufgenommen mit einem Leica AF6000E Fluoreszenzmikroskop Leica und Imaging-Software.
Discussion
Die heterokaryon Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und leicht interpretierbare Methode für die Charakterisierung von Zelltyp-spezifische Lokalisation Verhalten sowie nukleozytoplasmatischen pendelt Aktivität. Diese Methode nutzt die Empfindlichkeit des Fluoreszenz-Analyse sowie die Fähigkeit, Bilder lebender Zellen und führen Studien von Protein Dynamik. Die Technik ist einfach für viele verschiedene Zelltypen angepasst und ist zugänglich sowohl live als auch feste Cell Imaging. Zum Beispiel kann invertiert Fluoreszenzmikroskopie für Live-Imaging-und Zeitraffer-Video-Capture verwendet werden. Im Gegensatz dazu kann montiert Zellen entweder Epifluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung der steady-state Lokalisierungen oder detailliertere konfokale Bildgebung von diskreten Lokalisierungen verwendet werden. Darüber hinaus können Techniken wie die Fluoreszenz-Erholung nach Ausbleichen (FRAP), oder Fluoreszenz Verlust in photobleaching (FLIP) bei der Bestimmung der Lokalisierung Kinetik 1 verwendet werden. Die Einbindung von alternativen Fluorophoren in das Protokoll wäre für Protein-Wechselwirkung Experimente wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) in concert 2 durchgeführt werden können. Verschiedene Inhibitoren von zellulären Menschenhandel wie Leptomycin B oder dominant negative Ran GTPase Konstrukte verwendet werden, um die Abhängigkeit von bestimmten Ein-oder Ausfuhr Wege 5,6,9 etablieren.
- In bestimmten Experimenten mit Pendeln Aktivität, muss darauf geachtet werden Lokalisierung Effekte durch die Synthese neuer Proteine zu vermeiden. In diesen Fällen müssen Übersetzung Inhibitoren oder zeitlich begrenzt benutzt werden können. Dennoch bleiben Artefakte durch Inhibition der Translation eine Möglichkeit. Zellfusionen mit einer jeden Zelltyp sind die meisten für eine klare Interpretation der Shuttle-und Lokalisierungs-Verhalten gewünscht. Optimierung der Zellzahl und Fusion Bedingungen (Timing und Konzentration) kann es notwendig sein, um so günstige 1.01 Fusion Veranstaltungen zu fördern.
- Es ist wichtig, dass die Optimierung bestimmter Schritte in das Protokoll wird notwendig sein, abhängig von der jeweiligen Zelltypen verwendet beachten. Aspekte in der experimentellen Verfahren wie Fusion Effizienz, Transfektionseffizienz und Lebensfähigkeit nach der Fusion kann stark variieren zwischen Zelltypen. Insbesondere können primäre Zelltypen eine Herausforderung für die Verwaltung aufgrund der komplexen Kultur und niedrige Transfektionseffizienz. Einsatz von Technologien wie der Lonza Nucleofector Gerät kann für die schnelle Verarbeitung von Zellen sowie drastisch erhöht Transfektionseffizienz zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen Elektroporation Methoden für die einfache Übertragung von Zellen in Suspension zur Fusion Schritte, die folgen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten die Worcester Polytechnic Institute Institut für Chemie und Biochemie für die Finanzierung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
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