Summary
Un metodo flessibile ed efficiente per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici di localizzazione di proteine e nucleocytoplasmic spola è descritto. Questo approccio heterokaryon utilizza proteine di fusione fluorescenza-etichettati in modo da localizzazioni proteina immagine dopo la fusione cellulare. Il protocollo è suscettibile di steady-state localizzazioni o più determinazioni dinamici basati sull'imaging cellule vive.
Abstract
Un numero significativo di proteine sono regolate dal traffico subcellulare o nucleocytolasmic spola. Queste proteine visualizzare una gamma diversificata di funzioni cellulari incluse l'importazione nucleare / esportazione di RNA e proteine, regolazione trascrizionale, e l'apoptosi. È interessante notare che importanti riorganizzazioni cellulari tra cui la divisione cellulare, differenziamento e trasformazione, spesso comportano tali attività 3,4,8,10. Lo studio dettagliato di queste proteine e rispettivi meccanismi normativi può essere impegnativo come la stimolazione di questi cambiamenti di localizzazione possono essere sfuggente, ei movimenti si può essere molto dinamici e difficili da monitorare. Studi che hanno coinvolto oncogenesi cellulare, ad esempio, continueranno a beneficiare di percorsi di comprensione e di attività delle proteine che differiscono tra normali cellule primarie e cellule trasformate 6,7,11,12. Come molte proteine mostrano la localizzazione alterato durante la trasformazione o come risultato della trasformazione, dei metodi per caratterizzare in modo efficiente queste proteine e le vie a cui partecipano stand per migliorare la comprensione di oncogenesi e aprire nuovi settori di drug targeting.
Qui vi presentiamo un metodo per l'analisi del traffico di proteine e attività spola tra le cellule di mammifero primarie e trasformate. Questo metodo combina la generazione di fusioni heterokaryon con microscopia a fluorescenza per fornire un protocollo flessibile che può essere utilizzato per rilevare localizzazioni proteine allo stato stazionario o dinamico. Come mostrato nella Figura 1, due tipi di cellule separate sono transitoriamente transfettate con costrutti plasmide recante il gene fluoroprotein collegato al gene di interesse. Dopo l'espressione, le cellule si fondono con glicole polietilenico, e localizzazioni delle proteine possono poi essere ripreso con una varietà di metodi. Il protocollo presentato qui è un approccio fondamentale in cui le tecniche speciali, può essere aggiunto.
Protocol
1. Trasfezione di linee cellulari
Transfection Metodo 1
(Nucleofection Lonza per una maggiore efficienza di trasfezione delle cellule primarie)
- Le cellule devono essere di passaggio recente e in crescita log fase prima di trasfezione. Lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e le cellule raccolta da tripsinizzazione.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 5 minuti.
- Aggiungi scivola copertura sterile per un 6-pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata. Luogo 1,5 mL di terreni di coltura (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)) in ciascun pozzetto ed equilibrare i media nell'incubatrice.
- Raccogliere le cellule tripsinizzazione e risospendere in un volume minimo di tampone fosfato (PBS).
- Contare le celle e centrifugare la giusta quantità di risospensione di fornire ~ 5x10 5 cellule per campione.
- Risospendere le cellule con cura in 100 ul soluzione Nucleofector temperatura ambiente per campione.
- Combina 100 l di sospensione cellulare con 5 mg di DNA plasmidico e trasferimento del campione ad un Cuvette Nucleofector facendo attenzione a non includere bolle d'aria.
- Selezionare il programma appropriato Nucleofector (questo potrebbe richiedere test precedenti di stabilire l'efficienza ottimale di trasfezione con mortalità minima).
- Inserire la cuvetta contenente la cella / DNA sospensione nella portacuvette Nucleofector e avviare il programma selezionato.
- Al termine, rimuovere la cuvetta e aggiungere circa 500 ml di pre-equilibrato terreni di coltura ad esso (tratto dal 6 pozzetti).
- Trasferire immediatamente il campione in 6 pozzetti con volume finale di 1,5 mL per pozzetto. Le cellule devono essere placcato in entrambe le popolazioni miste o separatamente, per i controlli.
Trasfezione Metodo 2
(Qiagen trasfezione Effectene per linee cellulari)
- Preparare complessi trasfezione utilizzando il reagente Qiagen Effectene in primo luogo l'aggiunta di 0,8 mg di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di buffer CE.
- Aggiungere 6,4 microlitri di reagente enhancer a ciascun campione, miscelare brevemente muovendo il tubo, e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 microlitri di reagente Effectene ad ogni mix campione, muovendo il tubo, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Durante questa incubazione, preparare le due linee cellulari di interesse per la trasfezione. Lavare le cellule recentemente diversi passaggi (<80% confluenza), una volta in tampone fosfato (PBS). Aggiungi nuovo mezzo fresco 1,5 ml di crescita equilibrata e riscaldato (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)).
- Una volta che i complessi trasfezione hanno incubato per 15 minuti, trasferire 1,2 ml di media per ogni campione. Mescolare pipettando, e trasferire immediatamente ~ 700 ml di complessi a ciascuno dei due pozzi nel 6 pozzetti. Aggiungere goccia a goccia, e mescolare delicatamente facendo roteare il piatto. Consentono alle cellule di trasfezione per almeno 3 ore (può variare con il tipo di cellula).
- Aggiungi scivola copertura sterilizzati ad un nuovo cambio a 6 pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata.
- Dopo che le cellule sono transfettate, lavare le cellule due volte con PBS e raccogliere le cellule trysinization minimo con l'aggiunta di circa 100 microlitri soluzione tripsina in ogni pozzetto, agitare brevemente la piastra a cappotto completamente ogni bene, e subito aspirando la tripsina. Una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere 1,5 mL di mezzi freschi.
- A questo punto, le cellule devono essere placcato in popolazioni mista o separata (per i controlli) sul coprioggetto sterili.
- Consentono alle cellule di recuperare per 12 ore.
2. Fusione cellulare
- Togliere terreni di coltura dalle cellule e lavare due volte con PBS.
- A questo punto, si consiglia di trattare le cellule con cicloesimide (100 mg / ml) per inibire la sintesi proteica. Consentire alle cellule di incubare per 2 ore e poi lavare le cellule due volte con PBS.
- Cellule fusibile esponendoli ad una soluzione del 50% polietilenglicole 1000 (PEG 1000) in DMEM senza siero per 125 secondi a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS per rimuovere la soluzione di PEG 1000, e aggiungere 2 mL appena scaldato e media equilibrata.
- Consentono alle cellule ad incubare per 18 - 24 ore.
Microscopia a fluorescenza
- Rimuovere i terreni di coltura, e lavare le cellule due volte in PBS.
- Fissare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente per 15 minuti.
- Lavare le cellule fissate due volte in PBS.
- Rimuovere con cautela il coperchio scivola dalla piastra, stoppino in eccesso PBS. Inverti sul microscopio diapositive caricato con una goccia di mezzo di montaggio (90% glicerolo, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-ottano) contenente DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindolo).
- Rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio di diapositive, e sigillare cover scivola con smalto.
- Visualizzare le cellule mediante microscopia confocale o epifluorescenza.
3. Rappresentante Risultati
La Figura 2 mostra un esperimento heterokaryon esempio utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule cellule di carcinoma del polmone. La proteina di interesse in questo esperimento (Anemia di pollo Virus-VP3) mostra la localizzazione citoplasmatica principalmente in tipi di cellule primarie e di localizzazione nucleare in tipi di cellule trasformate come visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza. La proteina è espressa come fusione di due GFP (pEGFP-N1 vettore, Clontech) nei fibroblasti prepuzio primaria (PFF) o DsRed (DsRed-N1 vettore, Clontech) nelle cellule H1299. Campioni di controllo che coinvolge auto-fusioni (prime due righe) Display cellule multinucleate con nessun cambiamento nella steady-state modelli di localizzazione. Tali cambiamenti potrebbero altrimenti verificarsi a causa di sensibilità alle condizioni fusione o la formazione di sincizi. Fusioni Heterokaryon (riga in basso) dimostrano ingresso nucleare della GFP-fuso primario derivati dalle cellule e proteine colocalizzazione con la DsRed-proteina fusa in risposta alla introduzione di materiale cellula trasformata. L'esempio mostrato è una fusione heterokaryon relativamente rara risultante da due sole cellule, uno di ogni tipo, come dimostra la presenza di entrambi i segnali fluoroprotein. Oltre a rilevare questi tipi di transizioni di localizzazione, nucleocytoplasmic attività spola possono essere facilmente individuati dalla presenza di un fluoroforo in questi due nuclei. Questo tipo di dosaggio è chiaro in sede di esame 01:01 la fusione di cellule e dipenderà dalla inibizione della traduzione.
Figura 1. Diagramma di flusso del metodo heterokaryon utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule di carcinoma. Il gene di interesse viene clonato per produrre un telaio in fusione di uno dei due geni delle proteine fluorescenti. Linee cellulari sono poi transitoriamente trasfettate sia con il permesso di costruire e recuperare. Formazione Heterokaryon è indotta dal trattamento breve con polietilene glicole (PEG), seguita da incubazione ulteriormente. Infine, la localizzazione sub-cellulare della proteina di interesse viene osservata utilizzando varie forme di microscopia a fluorescenza.
Figura 2. Traffico Nucleocytoplasmic e spola attività della proteina di pollo Anemia Virus VP3 visualizzati da fusione heterokaryon. Riga superiore: immagini rappresentative di auto-H1299 fuso cellule che esprimono DsRed-VP3 fila Oriente:.. Rappresentante immagini epifluorescenza di cellule primarie di fibroblasti prepuzio (PFF) che esprime GFP-VP3 dopo la fusione PEG fila in basso: la fusione Heterokaryon di TFP e H1299 cellule. Giallo indica colocalizzazione di GFP e segnali DsRed. Le cellule sono state ripreso usando una Leica AF6000E microscopio a fluorescenza Leica e software di imaging.
Discussion
Il protocollo heterokaryon qui presentato fornisce un metodo efficiente e di facile interpretazione per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici comportamenti di localizzazione e nucleocytoplasmic attività spola. Questo metodo sfrutta la sensibilità di analisi di fluorescenza e la capacità di cellule immagine dal vivo e di eseguire studi di dinamica delle proteine. La tecnica si adatta facilmente a molti tipi di cellule diverse, ed è suscettibile di produrre immagini di cellule in vivo e fissati. Per esempio, invertito microscopia a fluorescenza può essere utilizzato per l'imaging dal vivo e lapse video in tempo. Al contrario, le cellule montate possono essere utilizzate sia in epifluorescenza per la determinazione dello stato stazionario localizzazioni o più dettagliate di imaging confocale di localizzazioni discreti. Inoltre, le tecniche come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), o la perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) può essere utilizzato nella determinazione della cinetica di localizzazione 1. L'incorporazione di fluorofori si alternano nel protocollo permetterebbe di esperimenti di interazione di proteine come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) da svolgere in concerto 2. Vari inibitori del traffico di cellulari come B leptomycin o dominante negativo costruisce GTPasi Ran può essere utilizzato per stabilire la dipendenza da particolari importazioni o esportazioni percorsi 5,6,9.
- In certi esperimenti che coinvolgono la spola attività, bisogna fare attenzione per evitare gli effetti di localizzazione grazie alla sintesi di nuove proteine. In questi casi, gli inibitori della traduzione o punti di tempo limitato deve essere utilizzato. Tuttavia, artefatti a causa dell'inibizione traslazionale rimanere una possibilità. La fusione di cellule contenenti una di ogni tipo cellulare sono più ambite per una chiara interpretazione della spola e del comportamento di localizzazione. Ottimizzazione del numero di cellule e le condizioni di fusione (tempi e concentrazione) può essere necessario per promuovere tale favorevole eventi di fusione 1:1.
- E 'importante notare che l'ottimizzazione di alcune fasi del protocollo sarà necessario a seconda delle particolari tipi di cellule usate. Aspetti della procedura sperimentale come l'efficienza di fusione, l'efficienza di trasfezione e vitalità dopo la fusione può variare notevolmente tra i tipi di cellule. In particolare, i tipi di cellule primarie può essere difficile da gestire a causa delle condizioni cultura complessa e bassa efficienza di trasfezione. Utilizzo di tecnologie come il dispositivo Lonza Nucleofector può permettere per l'elaborazione rapida delle cellule così come l'efficienza di transfezione aumentato drammaticamente. Inoltre, i metodi di elettroporazione consente un facile trasferimento di cellule in sospensione ai passi fusione che seguono.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Worcester Polytechnic Institute Dipartimento di Chimica e Biochimica per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
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