Summary
Um método flexível e eficiente para a caracterização de células localização de proteínas específicas do tipo e nucleocytoplasmic shuttling é descrito. Esta abordagem heterocário usa proteínas de fusão fluorescente marcado para localizações de proteína imagem após a fusão celular. O protocolo é passível de steady-state localizações ou mais determinações dinâmicas baseadas em imagens de células vivas.
Abstract
Um número significativo de proteínas são reguladas pelo tráfico ou subcelular nucleocytolasmic shuttling. Estas proteínas exibir uma gama diversificada de funções celulares, incluindo a importação nuclear / exportação de RNA e proteínas, regulação da transcrição e apoptose. Curiosamente, os principais reorganizações celulares, incluindo a divisão celular, diferenciação e transformação, muitas vezes envolvem tais atividades 3,4,8,10. O estudo detalhado destas proteínas e seus respectivos mecanismos de regulação pode ser um desafio como estímulo para essas mudanças de localização pode ser fugaz, e os próprios movimentos pode ser bastante dinâmico e difícil de controlar. Estudos envolvendo oncogênese celular, por exemplo, continuar a beneficiar do entendimento caminhos e atividades de proteínas que diferem entre normal pilhas e células transformadas 6,7,11,12. Como muitas proteínas mostrar a localização alterada durante a transformação ou como resultado de transformação, os métodos de forma eficiente caracterizar estas proteínas e as vias em que participam têm a melhorar a compreensão das oncogênese e abrir novas áreas para a droga segmentação.
Aqui apresentamos um método para a análise de proteínas e tráfico shuttling atividade entre primário e transformado em células de mamíferos. Este método combina a geração de fusões heterocário com microscopia de fluorescência para fornecer um protocolo flexível que pode ser usado para detectar proteínas localizações de estado estacionário ou dinâmico. Conforme mostrado na Figura 1, dois tipos de células são separadas transitoriamente transfectadas com construções plasmídeo carregando um gene fluoroprotein ligado ao gene de interesse. Depois de expressão, as células são fundidas usando polietileno glicol, e localizações proteína pode então ser fotografada usando uma variedade de métodos. O protocolo aqui apresentado é uma abordagem fundamental para que técnicas especializadas podem ser adicionados.
Protocol
1. Transfecção de linhas celulares
Método transfecção 1
(Lonza Nucleofection para a eficiência de transfecção de células primárias aumentada)
- As células devem ser de passagem recente e em crescimento log fase anterior à transfecção. Lavar as células em tampão fosfato salina (PBS) e células de colheita por tripsinização.
- Coletar células por centrifugação a 1500 xg por 5 minutos.
- Adicionar lamínulas esterilizadas a uma placa de seis poços. Lamínulas podem ser revestidos para a adesão celular reforçada. Coloque 1,5 mL de meios de cultura (neste caso, meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS)) em cada poço e equilibrar os meios de comunicação na incubadora.
- Colher as células por tripsinização e ressuspender em um volume mínimo de tampão fosfato (PBS).
- Contar as células e centrifugar a quantidade correta de ressuspensão de fornecer ~ 5x10 5 células por amostra.
- Ressuspender as células com cuidado em 100 mL de solução Nucleofector temperatura ambiente por amostra.
- Combine 100 L da suspensão de células com 5 mg DNA plasmidial e transferência da amostra para um Cuvette Nucleofector tomando cuidado para não incluir bolhas de ar.
- Selecione o programa apropriado Nucleofector (isso pode exigir testes anteriores para estabelecer a eficiência de transfecção ótima com a mortalidade mínima).
- Inserir a cubeta contendo a suspensão de células / DNA para o Titular Cuvette Nucleofector e iniciar o programa selecionado.
- Após a conclusão, remova a cubeta e adicione ~ 500 mL dos meios de comunicação pré-equilibradas cultura a ele (retirado da placa de 6 poços).
- Transferir imediatamente a amostra no prato 6-bem com volume final de 1,5 mL por poço. Células deve ser banhado em qualquer populações mistas ou separadamente, para os controles.
Método 2 transfecção
(Qiagen Effectene transfecção de linhas celulares)
- Prepare complexos transfecção usando o reagente Qiagen Effectene pela primeira adição de 0,8 mg de cada amostra de DNA plasmidial a 200 mL de buffer CE.
- Adicionar 6,4 mL de reagente potenciador para cada amostra, misturar brevemente sacudindo o tubo e incubar por 2 minutos em temperatura ambiente.
- Adicionar 20 mL de reagente Effectene a cada amostra de mistura, sacudindo o tubo e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Durante esta incubação, preparar a duas linhas de células de interesse para transfecção. Lave as células recentemente várias passagens (<confluência de 80%) uma vez em tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 1,5 mL de volta meio de crescimento fresco aquecido e equilibrado (neste caso, meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS)).
- Uma vez que os complexos de transfecção têm incubadas por 15 minutos, transferir 1,2 mL de mídia para cada amostra. Mix por pipetagem, e transferir imediatamente 700 mL ~ dos complexos a cada um dos dois poços na placa de 6 poços. Adicione gota a gota, e misture suavemente agitando o prato. Permitir que as células transfectar por pelo menos 3 horas (pode variar com o tipo de célula).
- Adicionar lamínulas esterilizadas a uma placa de 6-novo poço. Lamínulas podem ser revestidos para a adesão celular reforçada.
- Depois que as células têm transfectadas, lave as células duas vezes com PBS e colher as células por trysinization mínima, adicionando cerca de 100 mL de solução de tripsina a cada poço, agitar brevemente a placa de revestimento totalmente cada poço, e imediatamente aspiração fora da tripsina. Uma vez que as células têm levantado, adicionar 1,5 mL de mídia fresco.
- Neste ponto, as células devem ser banhado em populações mistos ou separados (para controles) para o lamínulas estéreis.
- Permitem que as células para recuperar por 12 horas.
2. Fusão celular
- Remova a mídia de cultura de células e lavar duas vezes com PBS.
- Neste ponto, é recomendado para tratar as células com cicloheximida (100 mcg / mL) para inibir a síntese de proteínas. Permitir que as células para incubar por 2 horas e depois lave as células duas vezes com PBS.
- Células fusível, expondo-os a uma solução de 50% de polietileno glicol 1000 (PEG 1000) no soro livre de DMEM para 125 segundo a temperatura ambiente.
- Lavar as células com PBS para remover a solução de PEG 1000, e adicionar 2 mL recém-aquecido e media equilibrada.
- Permitir que as células incubar por 18-24 horas.
Microscopia de fluorescência
- Remova a mídia, cultura e lave as células duas vezes em PBS.
- Fix células adicionando 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agite suavemente por 15 minutos.
- Lave as células fixas duas vezes em PBS.
- Remova cuidadosamente a lamínulas da placa, pavio off PBS excesso. Inverter para microscópio slides carregado com uma gota de meio de montagem (90% de glicerol, 100mM Tris pH 7,5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo octanagem) contendo DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole).
- Retire o excesso de meio de montagem das lâminas, e selar cover desliza com unha polonês.
- Visualize as células através de microscopia confocal ou epifluorescência.
3. Resultados representante
A Figura 2 mostra um experimento heterocário exemplo usando fibroblastos primários e H1299 de células não pequenas células de carcinoma de pulmão. A proteína de interesse neste experimento (Chicken Anemia Virus-VP3) exibe a localização citoplasmática principalmente em tipos de células primárias e localização nuclear em tipos de células transformadas como visualizado por microscopia de epifluorescência. A proteína é expressa como uma fusão ou GFP (pEGFP-N1 vetor, Clontech) em fibroblastos prepúcio primária (PFF) ou dsRed (dsRed-N1 vetor, Clontech) em células H1299. Amostras de controle que envolve auto-fusão (duas primeiras linhas) exibir células multinucleadas, sem qualquer alteração nos padrões de steady-state de localização. Tais mudanças poderiam ocorrer devido a sensibilidade às condições de fusão ou a formação de syncitia. Fusões heterocário (linha inferior) demonstram entrada nuclear da proteína GFP-fundidas derivadas de células-primária e co-localização com a proteína dsRed fundida em resposta à introdução de material celular transformada. O exemplo mostrado é uma fusão heterocário relativamente rara, resultante de apenas duas células, uma de cada tipo, como demonstrado pela presença de ambos os sinais fluoroprotein. Além de detectar estes tipos de transições de localização, atividade shuttling nucleocytoplasmic pode ser facilmente detectada pela presença de um fluoróforo única em ambos os núcleos. Este tipo de determinação é clara quando se examina 01:01 fusão de células e dependeria de inibição da tradução.
Figura 1. Fluxograma do método heterocário usando fibroblastos primários e H1299 não-pequenas células de carcinoma de células. O gene de interesse é clonado para produzir uma fusão em frame-a um dos dois genes da proteína fluorescente. Linhas de células são, então, transitoriamente transfectadas com tanto construir e tempo para se recuperar. Heterocário formação é induzida pelo tratamento breve com polietileno glicol (PEG), seguido por incubação adicional. Finalmente, a localização sub-celular da proteína de interesse é observado usando várias formas de microscopia de fluorescência.
Figura 2. Tráfico Nucleocytoplasmic e shuttling atividade da proteína Anemia Virus Chicken VP3 visualizado por fusão heterocário. Linha superior: Imagens representativas de auto-fusão H1299 células que expressam dsRed-VP3 linha Médio:.. Representante imagens de epifluorescência das células do prepúcio primárias de fibroblastos (PFF) expressando GFP-VP3 após a fusão PEG Linha inferior: a fusão heterocário de PFF e H1299 células. Amarelo indica co-localização de GFP e sinais dsRed. As células foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência Leica AF6000E Leica e software de imagem.
Discussion
O protocolo heterocário apresentado aqui fornece um método eficiente e facilmente interpretável para a caracterização de células comportamento de localização de tipo específico, assim como a atividade shuttling nucleocytoplasmic. Este método aproveita a sensibilidade de análise de fluorescência, bem como a capacidade de células de imagem ao vivo e realizar estudos da dinâmica de proteínas. A técnica é facilmente adaptado para vários tipos de células diferentes e é passível de ambas as imagens de células vivas e fixas. Por exemplo, a microscopia de fluorescência invertido pode ser usado para geração de imagens ao vivo e captura de vídeo em tempo lapso. Em contraste, as células montado pode ser utilizado em qualquer microscopia de epifluorescência, para determinação do estado estacionário ou localizações mais detalhada imagem confocal de localizações discretas. Além disso, técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP), ou perda de fluorescência em fotobranqueamento (FLIP) pode ser usado na determinação da cinética de localização 1. A incorporação de fluoróforos alternativo no protocolo permitiria experimentos de interação de proteínas como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a ser realizada em conjunto 2. Vários inibidores de tráfico de celulares, tais como B leptomycin ou negativo dominante Ran constrói GTPase pode ser usada para estabelecer a dependência de importação particular ou vias de exportação 5,6,9.
- Em certos experimentos envolvendo shuttling atividade, os cuidados devem ser tomados para evitar os efeitos de localização, devido à síntese de novas proteínas. Nestes casos, os inibidores da tradução ou pontos de tempo limitado deve ser usado. No entanto, artefatos devido à inibição traducional continuam a ser uma possibilidade. Fusão de células que contêm um de cada tipo de célula são mais desejados para a interpretação clara do shuttling e comportamento de localização. Otimização do número de células e as condições de fusão (tempo e concentração) pode ser necessário para promover tais eventos de fusão favoráveis 01:01.
- É importante notar que a otimização de determinadas etapas no protocolo serão necessários dependendo dos tipos de célula em particular usados. Aspectos do procedimento experimental, como a eficiência de fusão, a eficiência de transfecção e viabilidade após a fusão pode variar muito entre os tipos de células. Em particular, os tipos de célula primária pode ser um desafio para gerenciar devido às condições de cultura complexa e eficiências de transfecção baixo. Uso de tecnologias como o dispositivo Nucleofector Lonza pode permitir o processamento rápido de células, bem como a eficiência de transfecção aumentou dramaticamente. Além disso, os métodos de eletroporação permitir a fácil transferência de células em suspensão para as etapas de fusão que se seguem.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Worcester Polytechnic Institute Departamento de Química e Bioquímica para financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Trypsin | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30243FS | High glucose |
| paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF kit | Lonza Inc. | VPD-1001 |
References
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