Summary
कीट घ्राण प्रणाली (ईएजी) electroantennograms और एकल sensillum (SSR) रिकॉर्डिंग, जो सभी odorant रिसेप्टर (ORNs) न्यूरॉन्स एंटीना पर स्थित है और व्यक्ति में रखे उन लोगों से प्रतिक्रिया अभिव्यक्त कर रहे हैं के रूपों में odorant प्रेरित रिकॉर्डिंग प्रतिक्रियाओं के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करते हैं sensilla क्रमशः.
Abstract
कीट घ्राण प्रणाली (ईएजी) electroantennograms और एकल sensillum (SSR) रिकॉर्डिंग, जो सभी odorant रिसेप्टर (ORNs) न्यूरॉन्स एंटीना पर स्थित है और व्यक्ति में रखे उन लोगों से प्रतिक्रिया अभिव्यक्त कर रहे हैं के रूपों में odorant प्रेरित रिकॉर्डिंग प्रतिक्रियाओं के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करते हैं sensilla क्रमशः. कीट रासायनिक संचार का एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए इन तरीकों का शोषण किया है. पहचान उत्तेजनाओं तो संक्रामक कीटों के लिए प्रबंधन रणनीति में या तो attractants या repellents के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. कीड़े
- नाभि orangeworm, Amyelois (वाकर) transitella (Lepidoptera: Pyralidae) हमारे Fresno, CA में बादाम के पेड़ से एकत्र पतिंगे से उत्पन्न प्रयोगशाला में कॉलोनी . हमारे कीड़े कॉलोनी पर्यावरण कक्षों (पेर्सिवल इंक, आइए) में 28 पर बनाए रखा है. 2 ± ° सी, ± 10% सापेक्ष आर्द्रता 75, और 16:08 घंटे के तहत (प्रकाश: अंधेरे) फोटो शासन.
- उभरते पतिंगे दैनिक एकत्र कर रहे हैं, sexed, और प्लास्टिक बक्से (669 एमएल lunchbox, 13 x 13 सेमी, ऊंचाई, 4.5 सेमी, Rubbermaid) को हस्तांतरित के साथ प्रदान की पानी लथपथ कागज तौलिए के 10 परतों (प्यासे अल्ट्रा शोषक, 27.9 x 27.9 सेमी ; Safeway). बॉक्स कवर के लिए हवा परिसंचरण की अनुमति छेदा हैं. यह व्यवस्था ~ 100% आरएच प्रदान करता है.
- Electrophysiological माप के लिए हम 2-4 दिनों के उद्भव, जो उच्च आर्द्रता के तहत रखा जाता है के बाद पुराने पतिंगे का उपयोग करें.
2. Electrophysiological तैयारी
- पतिंगे (पुरुषों या महिलाओं) को धीरे से एक विंदुक (200 μL, संयुक्त राज्य अमेरिका वैज्ञानिक इंक) टिप है कि ऊपर से कट जाता है एक बड़े (ca. मिमी 2) टिप व्यास में धकेल दिया जाता है. एक कीट धीरे एक humidified ऊतक कागज ठूंठ के साथ दूसरे छोर के माध्यम से धक्का दिया है जब तक एंटीना और सिर का हिस्सा टिप बहर से.
- उजागर सिर एक गैर सुखाने मिट्टी (Claytoon, वान Aken इंटरनेशनल, सीए) एक आंख और दो एंटीना उजागर का एक छोटा सा हिस्सा छोड़ने के साथ सिर को कवर द्वारा immobilized है. यह तैयारी ईएजी सांसद दो इलेक्ट्रोड धारकों के बीच 12 micromanipulator (Syntech, जर्मनी) के एक मंच पर रखा गया है.
- हम गिलास फिलामेंट के साथ 1.0 मिमी borosilicate केशिका टयूबिंग (डब्ल्यूपीआई इंक, FL) से बना है और एक मॉडल P-97 micropipette डांड़ी (Sutter उपकरण, सीए) में खींच करने के लिए कम से कम एक micrometer टिप microelectrodes प्राप्त इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. इलेक्ट्रोड वापस sensillum लसीका घंटी (Kaissling और Thorson 1980) के साथ भर रहे हैं. एक इलेक्ट्रोड खुर्दबीन (Leica MZ75) के तहत आँख के उजागर क्षेत्र impales और संदर्भ के रूप में में कार्य करता है, जबकि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दो एंटीना accommodates. संपर्क को सुविधाजनक बनाने के लिए, बाहर का 1-2 antennal क्षेत्रों रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में डाला जा रहा से पहले काट रहे हैं. व्यक्तिगत sensilla से रिकॉर्डिंग संकेतों के लिए, हम थोड़ा इस सेटअप है जिसमें रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड माइक्रोस्कोप (800x बढ़ाई ओलिंप BX51WI) के तहत impaled है संशोधित. लड़ाई क्षमता sensillum के आधार पर कांच इलेक्ट्रोड डालने से दर्ज कर रहे हैं. सिग्नल एक उच्च प्रतिबाधा पूर्व प्रवर्धक (Syntech, जर्मनी) और खिलाया द्वारा एक विश्लेषण किया यूबी IDAC AUTOSPIKE सॉफ्टवेयर (Syntech, जर्मनी) के साथ बंद लाइन में परिलक्षित हैं. एसी संकेतों बैंड 100 -10,000 हर्ट्ज और कार्रवाई की क्षमता के बीच फ़िल्टर पारित कर रहे हैं एक AUTOSPIKE एल्गोरिथ्म है कि शोर से अपने चरम करने के लिए गर्त आयाम अलग का उपयोग कर कंप्यूटर द्वारा निकाले जाते हैं. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के जवाब में संभावित कार्रवाई आवृत्ति (या कमी) सहज आवृत्ति से अधिक (प्रति सेकंड spikes) वृद्धि के रूप में की गणना कर रहे हैं.
3. रासायनिक उत्तेजनाओं और उत्तेजना प्रोटोकॉल
- उच्चतम शुद्धता के रसायन का इस्तेमाल कर रहे हैं. नाभि orangeworm से महिला फेरोमोन मिश्रण का एक प्रमुख घटक है, (जेड, जेड) -11,13 - hexadecadienal Bedoukian रिसर्च इंक, सीटी से प्राप्त हुई थी. रसायन पतला कर रहे हैं, w / v गिलास आसुत hexane 10 μg / μL और decadic dilutions के शेयर समाधान बनाने के साथ बना रहे हैं. एक उत्तेजना hexane में भंग रासायनिक (10 μL) के एक विभाज्य एक वाटमान फिल्टर पेपर पट्टी (8x40 मिमी) पर भरी हुई है, विलायक धीरे से एक धूआं हुड के अंतर्गत 10 s के लिए झटकों से सुखाया जाता है और पट्टी एक 5 एमएल polypropylene में रखा गया है सिरिंज (बी सीरिंज, न्यू जर्सी) से जो विभिन्न संस्करणों निकली हैं. हेक्सेन अकेले और एक खाली सिरिंज नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
- तैयारी humidified हवा Syntech उत्तेजना नियंत्रक (सीएस 55-मॉडल, Syntech, जर्मनी) द्वारा दिया धारा में आयोजित किया जाता है पर 20 एमएल / सेक जो 4 के एक प्रोत्साहन पल्स एमएल / 500 एमएस के लिए जोड़ा जाता है. सिग्नल 10 s के लिए दर्ज हैं, उत्तेजना नाड़ी की शुरुआत से पहले 2 एस शुरू. Antennal तैयारी ca जिसके दौरान 500 एमएस नाड़ी के साथ प्रेरित है. 5 एमएल polypropylene उत्तेजना युक्त सिरिंज से शुद्ध हवा के 2 एमएल मुख्य वायु प्रवाह पर जोड़ा जाता है. कम से कम 1 मिनट या उससे अधिक के एक अंतर है, उच्च प्रतिक्रियाओं का पालन, stimulations के बीच की अनुमति दी है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
महिला फेरोमोन घटक के साथ प्रेरित रोका पतिंगे के एंटीना (चित्रा 1), (जेड, जेड) -11,13 hexadecadienal मजबूत खुराक निर्भर प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2) उत्पन्न. इस प्रमुख फेरोमोन घटक भी लंबे trichodea sensilla (चित्रा 3A) के रूप में एकल इकाई रिकॉर्डिंग (3B चित्रा) के निशान में प्रदर्शित से खुराक निर्भर उत्तेजक प्रतिक्रियाएं elicits.
चित्रा 1. नाभि orangeworm कीट रोका और ऐन्टेना उजागर लाइव
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चित्रा 2. खुराक निर्भर ईएजी प्रतिक्रियाओं के जवाब में हासिल (जेड, जेड) -11,13 hexadecadienal, एक प्रमुख महिला फेरोमोन घटक.
चित्रा 3. पुरुष नाभि orangeworm कीट में Sensilla trichoid का जवाब (जेड, जेड) एक खुराक निर्भर तरीके में -11,13 hexadecadienal. (ए) पुरुष नाभि orangeworm कीट की बहु - खंडों एंटीना और प्रत्येक खंड संरचनाओं की तरह एक बाल की एक बड़ी संख्या, sensilla के साथ सजी है. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में विवरण दिखाने इनसेट (स्केल सलाखों के 200 और 50 सुक्ष्ममापी हैं, क्रमशः). (बी) एक trichoid sensillum से कोशिकी एकल इकाई रिकॉर्डिंग.
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Discussion
यह उपन्यास एक जीवित नाभि orangeworm कीट निरोधक घ्राण संकेतों को मापने के लिए विधि विकसित करने के लिए मजबूत और बहुत विश्वसनीय साबित हुई है. हम नियमित रूप से अलग और बादाम और पिस्ता जैसे प्राकृतिक मेजबान substrates से उपन्यास attractants की पहचान करने के लिए इस विधि को रोजगार.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, 0918177 NSF, और Bedoukian अनुसंधान निगमन द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
