Summary
昆虫の嗅覚システムは、アンテナ上にあるすべての嗅覚受容体の神経細胞（ORNs）から、個々に収容されたものからの応答を加算しているelectroantennograms（EAG）と、単一感覚子記録（SSR）の形で記録嗅覚誘発応答のためのユニークな機会を提供するそれぞれ感覚器、。
Abstract
昆虫の嗅覚システムは、アンテナ上にあるすべての嗅覚受容体の神経細胞（ORNs）から、個々に収容されたものからの応答を加算しているelectroantennograms（EAG）と、単一感覚子記録（SSR）の形で記録嗅覚誘発応答のためのユニークな機会を提供するそれぞれ感覚器、。これらのアプローチは、昆虫の化学通信のより良い理解を得るために悪用されている。特定された刺激は、病害虫の管理戦略の誘引や忌避剤のどちらかとして使用することができます。
Protocol
1。昆虫
- へそorangeworm、Amyelois transitella（ウォーカー）（鱗翅目：メイガ科）フレズノ、カリフォルニア州のアーモンドの木から採取した成虫から発信された私たちの研究室でのコロニー。写真政権：私達の昆虫のコロニーは、± 2℃、75 ± 10％相対湿度、および午前16時08分H（暗い光）下で28℃（パーシバル社、IA）環境槽内に保持されます。
- 新興蛾は、毎日収集性欲を刺激する、そしてプラスチックの箱（669 mLの弁当箱、13 × 13センチメートル、高さ、4.5センチ、ラバーメイド）に転送され、水に浸したペーパータオル（27.9、喉が渇いた超吸収X 27.9センチメートルの10層までで提供;セイフウェイ）。ボックスカバーは、空気循環を可能にするために穴あきです。この配置は、〜100％RHを提供します。
- 電気生理学的測定のために我々は、高湿度下に保持されますが出現、後2〜4日の古い蛾を使用してください。
2。電気生理学的準備
- 蛾（男性または女性）が静かに大規模な（約2mm）を先端径を持つように上部から切断されたピペットチップ（200μL、米国サイエンティフィック株式会社）にプッシュされます。アンテナと頭の部分が先端から突出するまで蛾を穏やかに加湿ティッシュペーパーのスタブを持つもう一方の端を通してプッシュされます。
- 露出頭は片目と公開される2つのアンテナのごく一部を残して不乾性粘土（Claytoon、バンアーケンインターナショナル、カリフォルニア州）で頭を覆うことによって固定化されている。この準備は、2つの電極ホルダーの間にEAGマニピュレーターMP - 12（Syntech、ドイツ）のプラットフォームに配置されます。
- 私たちは、フィラメントと1.0ミリメートルホウケイ酸キャピラリーチューブから作られたガラス電極を使用して（WPI社、FL）とマイクロチップ未満の微小電極を得るためにモデルP - 97マイクロピペットプラー（サターインスツルメンツ、CA）でプルアップ。電極はバック感覚子リンパリンガー（Kaisslingとソーソン1980）で埋められます。一方の電極は、顕微鏡（ライカMZ75）の下で目の露出面積をimpalesと記録電極は、二つのアンテナを収納しながら、参照として機能します。接触を容易にするために、遠位1〜2触角のセグメントは、記録電極に挿入される前にカットされています。個々の感覚器からの記録信号の場合、我々はわずかに記録電極を顕微鏡（; 800 ×倍率オリンパスBX51WI）の下impaledされることを特徴この設定を変更します。活動電位は、感覚子の基部にガラス電極を挿入して記録されます。シグナルは、AUTOSPIKEソフトウェア（Syntech、ドイツ）と分析されるUB - IDACオフラインにハイインピーダンスプリアンプ（Syntech、ドイツ）と供給によって増幅されています。バンドは、100 -10000 Hzと活動電位との間でフィルタリング通過しているAC信号がノイズから彼らのピークツー谷の振幅を区別AUTOSPIKEアルゴリズムを使用してコンピュータによって抽出されます。個々のニューロンの応答は、自発的な周波数に対する活動電位の頻度の増加（または減少）（毎秒スパイク）として計算されます。
3。化学的刺激と刺激のプロトコル
- 最高純度の化学薬品が使用されます。へそのorangewormから女性フェロモンブレンドの主要成分、（Z、Z）-11,13 - hexadecadienalはBedoukianリサーチ社、CTから得られた。化学物質が希釈され、10μg/μLのと進法希釈のストック溶液を作るためにガラス蒸留ヘキサンとのW / Vは、作られています。ヘキサンに溶解した刺激の化学物質のアリコート（10μl）を溶媒としては、静かに換気フードの下に10秒間振とうすることにより蒸発させ、ストリップを5 mLのポリプロピレンに配置され、（8x40 mm）のワットマンろ紙片上にロードさ様々なボリュームが取り出されているからシリンジ（BDシリンジ、NJ）。ヘキサン単独で、空の注射器は、コントロールとして使用。
- 準備がSyntech刺激コントローラ（CS - 55モデル、Syntech、ドイツ）が提供する加湿空気の流れで開催される20 ml /秒でそのための4mL /秒の刺激パルスは500ミリ秒のために追加されます。信号は、刺激パルスの開始前に2秒を開始、10秒間記録されます。触角の準備はどのCAの間に500 msのパルスで刺激されています。刺激を含む5mLのポリプロピレンシリンジから精製された空気の2mLをメイン空気の流れの上に追加されます。高応答、以下の少なくとも1分以上のギャップが、、刺激の間で許可される。
4。代表的な結果
控えめな蛾の触角（図1）女性のフェロモン成分で刺激、（Z、Z）-11,13 - hexadecadienal堅牢な用量依存性の応答（図2）を生成する。この主要なフェロモン成分はまた、単一ユニット記録（図3B）のトレースに表示される長いtrichodea感覚器（図3A）から用量依存性の興奮性応答を誘発する。
図1。ライヴへそorangeworm蛾抑制され、アンテナが露出し
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図2。用量依存性のEAG応答は（Z、Z）-11,13 - hexadecadienal、主要な女性のフェロモン成分に反応して誘発した。
男性のへそorangeworm蛾の図3。感覚器の毛髪状のは、用量依存的に（Z、Z）-11,13 - hexadecadienalに対応。 （A）オスへそorangeworm蛾のアンテナは、複数のセグメントであり、各セグメントは、構造体のような毛の数が多い、感覚器で飾られています。挿入図に詳細を示す走査型電子顕微鏡写真、（スケールバーはそれぞれ、200および50μMです）。毛状感覚子から（B）細胞外単一ユニット記録。
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Discussion
嗅覚信号を測定するために、ライブへそorangewormの蛾を抑制するために開発されたこの新しい方法は、堅牢で非常に信頼性が高いことが証明されている。我々は日常的にアーモンドやピスタチオなどの自然宿主の基質から小説誘引を分離し、識別するためにこの方法を採用しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582、NSF 0918177、およびBedoukian研究の定款によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
