Summary
곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla.
Abstract
곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla. 이러한 접근 방식은 곤충 화학 통신의 이해를 얻을 수 악용되었습니다. 식별 자극 그러면 곤충 해충에 대한 경영 전략에 attractants 또는 repellents 형식으로 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 곤충
- 배꼽 orangeworm, Amyelois transitella (워커) (Lepidoptera : Pyralidae) 프레스노, 캘리포니아 아몬드 나무에서 수집된 나방에서 유래 우리 연구실에 식민지. 우리 곤충의 식민지가 28 환경 챔버 (퍼시벌 병원, IA)에 유지됩니다 ± 2 ° C, 75 ± 10 % 상대 습도, 그리고 16시 8분 H 이하 (조명 : 어두운) 사진 정권.
- 신흥 나방은 sexed, 매일 수집, 플라스틱 상자 (669 ML 도시락, 13 X 13cm, 높이 4.5 cm, Rubbermaid)으로 전송됩니다 물에 젖었을 종이 타올 10 레이어 (함께 최대 제공 썰스티 울트라 흡수제, 27.9 X 27.9 cm ; 세이프). 박스 커버는 공기 순환을 허용하는 구멍이 있습니다. 이 협정 ~ 100 % RH를 제공합니다.
- electrophysiological 측정 우리는 높은 습도에 따라 보관 출현 이후 2-4일에게 이전 나방을 사용합니다.
2. Electrophysiological 준비
- 나방 (남성 또는 여성)이 부드럽게 대형 (ca. 2mm) 팁 직경을 가지고 가기에서 절단하는 피펫 팁 (200 μL, 미국 과학 부동산)에 적용됩니다. 안테나와 머리 부분 끝에서 내다까지 나방은 부드럽게 humidified 티슈 스텁과 다른 쪽 끝을 통해 밀고있다.
- 노출된 머리는 한 눈 두 안테나 노출의 작은 부분을 떠나는가 아닌 건조 점토 (Claytoon, 반 아켄 국제, CA)으로 머리를 덮고으로 움직일 수 있습니다. 이 준비는 두 전극 홀더 사이 EAG Micromanipulator MP - 12 (Syntech, 독일)의 플랫폼에 배치됩니다.
- 우리는 필라멘트와 1.0 mm borosilicate 모세관 튜브 (WPI 병원, FL)에서 만든 마이크로 미터 팁 미만의 microelectrodes를 얻는 모델 P - 97 micropipette 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, CA)에서 가져온 유리 전극을 사용합니다. 전극 다시 sensillum 림프 울리는 (Kaissling 및 쏘슨 1980)로 가득합니다. 기록 전극은 두 안테나를 수용하면서 하나의 전극은 현미경 (Leica MZ75)에서 안구의 노출된 영역을 impales 및 참조 역할을합니다. 연락처를 촉진하기 위해 말초 1-2 antennal 구간은 기록 전극에 삽입되기 전에 절단됩니다. 개인 sensilla에서 녹음 신호를 위해, 우리는 약간 기록 전극은 현미경 (; 800x 배율 올림푸스 BX51WI) 아래 찔려 죽은 것입니다 궁극적이 설정을 수정합니다. 액션 잠재력은 sensillum의 기지에서 유리 전극을 삽입하여 기록됩니다. 신호 AUTOSPIKE 소프트웨어 (Syntech, 독일)로 분석하는 UB - IDAC 오프라인에 높은 임피던스 사전 증폭기 (Syntech, 독일)와 공급에 의해 증폭됩니다. AC 신호는 100 Hz에서 -10,000 및 행동 잠재력 사이의 필터링 밴드 패스 아르는 소음으로부터 피크 - 투 - 트러프 amplitudes 구별 AUTOSPIKE 알고리즘을 사용하여 컴퓨터에서 추출됩니다. 개별 뉴런의 반응은 자발적인 주파수를 통해 실천 가능성 주파수의 증가 (또는 감소) (초당 스파이크)로 계산됩니다.
3. 화학 자극 자극 프로토콜
- 높은 순도의 화학 물질이 사용됩니다. 배꼽 orangeworm에서 여성 페로몬의 조화의 주요 구성 (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal이 Bedoukian 연구 병원, CT로부터 얻은 것입니다. 화학 물질이 희석 아르, 10 μg / μL 및 decadic dilutions 재고 솔루션을 만들기 위해 유리 소주 헥산과 W / V가 만들어집니다. 헥산에 녹아있는 자극 화학 나누어지는 (10 μL)이 왓먼 필터 종이 스트립 (8x40 ㎜)에 로드된, 용매는 부드럽게 퓸 후드 아래에 10 S에 대한 흔들어에 의해 증발되고 스트립은 5 ML의 폴리 프로필렌에 배치됩니다 주사기는 (BD 주사기, NJ)있는 다양한 볼륨이 배출됩니다. 헥산 혼자와 빈 주사기는 컨트롤 역할을합니다.
- 준비가 Syntech의 자극 컨트롤러 (CS - 55 모델, Syntech, 독일)에 의해 전달되는 humidified 공기 흐름에서 개최됩니다 20 ML / 초 수있는 ML / s의 500 MS에 대한 추가 4 자극 펄스. 신호는 자극 펄스의 시작 전에 2 S를 시작, 10 s에 대한 기록됩니다. Antennal 준비 500 MS 펄스와 함께하는 CA 동안 자극합니다. 자극을 포함하는 5 ML의 폴리 프로필렌의 주사기에서 공기 정화 2 ML은 주요 공기 흐름에 추가됩니다. 높은 응답을 다음과 같은 최소한 1 분 이상의 격차는, stimulations 사이에 허용됩니다.
4. 대표 결과
구속 나방의 안테나 (그림 1) 여성 페로몬 성분과 자극, (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal 강력한 선량에 의존 반응 (그림 2)를 생성합니다. 이 주요 페로몬 구성 요소는 또한 하나의 단위 기록 (그림 3B)의 흔적이 표시 긴 trichodea sensilla (그림 3A)에서 선량 의존 흥분성의 응답을 elicits.
그림 1. 노출 배꼽 orangeworm 나방 구속과 안테나를 라이브
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그림 2. 선량 의존 EAG의 응답에 대한 응답으로 elicited (Z, Z) -11,13 - hexadecadienal, 주요 여성 페로몬 성분.
그림 3. 남성의 배꼽 orangeworm 나방의 Sensilla의 trichoid는 응답 (Z, Z) 복용에 의존 방식으로 -11,13 - hexadecadienal. (A) 남자 배꼽 orangeworm 나방의 안테나는 다중 분할하고 각 세그먼트는 구조물 같은 머리의 많은, sensilla로 장식되어있다. 의 세부 정보를 보여주는 스캐닝 전자 현미경, 삽입된 페이지 (스케일 바는 각각 200 및 50 μm의됩니다.) trichoid sensillum에서 (B) 세포 단일 단위 녹음.
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Discussion
후각 신호를 측정하는 라이브 배꼽 orangeworm와 나방을 억제하기 위해 개발이 소설 방법은 강력하고 매우 안정적인 것으로 판명되었습니다. 우리는 일상적으로 아몬드와 피스타치오와 같은 자연 호스트 기판에서 소설 attractants을 분리하고 식별이 방법을 사용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0,918,177, 그리고 Bedoukian 연구 설립 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
