Summary
Inseto sistemas olfativos fornecem oportunidades únicas para a gravação odorant induzida por respostas nas formas de electroantennograms (EAG) e gravações sensillum simples (SSR), que são somadas as respostas de todos os neurônios olfativos receptor (ORNS), localizado na antena e daqueles alojados em individuais sensilla, respectivamente.
Abstract
Inseto sistemas olfativos fornecem oportunidades únicas para a gravação odorant induzida por respostas nas formas de electroantennograms (EAG) e gravações sensillum simples (SSR), que são somadas as respostas de todos os neurônios olfativos receptor (ORNS), localizado na antena e daqueles alojados em individuais sensilla, respectivamente. Essas abordagens têm sido exploradas para obter uma melhor compreensão da comunicação química de insetos. Os estímulos identificados podem ser usados tanto como atrativos ou repelentes nas estratégias de gestão para pragas de insetos.
Protocol
1. Insetos
- Umbigo orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) colônia em nosso laboratório originado de mariposas coletadas de amendoeiras em Fresno, CA. Nossa colônia de insetos são mantidos em câmaras climáticas (Percival Inc, IA) a 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% de umidade relativa, e sob 16:08 h (luz: escuro) foto regime.
- Mariposas emergentes são coletados diariamente, sexados e transferidos para caixas de plástico (669 mL lancheira, 13 x 13 cm, altura, 4,5 cm, Rubbermaid) fornecido com até 10 camadas de toalhas de papel embebido de água (Thirsty Ultra Absorvente, 27,9 x 27,9 cm ; Safeway). Tampas de caixas são perfuradas para permitir a circulação de ar. Esse arranjo fornece ~ 100% RH.
- Para medições eletrofisiológicas usamos 2-4 dias após a emergência das mariposas de idade, que são mantidos sob alta umidade.
2. Preparação eletrofisiológicas
- Mariposas (machos ou fêmeas) são gentilmente empurrado para uma ponteira (200 mL, EUA Scientific Inc) que é cortado de cima para ter um diâmetro da ponta de grande porte (ca. 2 mm). A mariposa é delicadamente empurrado através da outra extremidade com uma ponta de lenço de papel umedecido, até as antenas e parte da cabeça se projetam a partir da ponta.
- Cabeça exposta é imobilizado, cobrindo a cabeça com uma argila não-secagem (Claytoon, Van Aken International, CA), deixando uma pequena parte de um olho e duas antenas expostas. Esta preparação é colocado sobre uma plataforma do micromanipulador EAG MP-12 (Syntech, Alemanha) entre os dois titulares do eletrodo.
- Usamos eletrodo de vidro feita a partir de 1,0 milímetros tubos capilares de borosilicato com filamento (WPI Inc, FL) e puxou em um modelo P-97 micropipeta extrator (Sutter Instruments, CA) para obter microeletrodos de menos de uma ponta micrômetro. Eletrodos estão de volta cheio de sensillum linfáticos campainha (Kaissling e Thorson 1980). Um eletrodo empala a área exposta do olho sob o microscópio (Leica MZ75) e serve como referência, enquanto o eletrodo de registro acomoda as duas antenas. Para facilitar o contato, distal 1-2 segmentos antenais são cortadas antes de ser inserido no eletrodo de registro. Para gravações de sinais de sensilla individuais, modificar um pouco essa configuração em que o eletrodo de registro é empalado sob o microscópio (Olympus BX51WI; 800x de ampliação). Potenciais de ação são registrados, inserindo o eletrodo de vidro na base de um sensillum. Sinais são amplificados por uma alta impedância pré-amplificador (Syntech, Alemanha) e alimentado em um UB-IDAC a serem analisados off-line com AUTOSPIKE software (Syntech, Alemanha). AC sinais passa-banda são filtradas entre 100 Hz -10.000 e potenciais de ação são extraídos por computador usando um algoritmo AUTOSPIKE que distingue o seu pico-cocho para-amplitudes do ruído. Respostas dos neurônios individuais são calculadas como o aumento (ou diminuição) na freqüência de potencial de ação (picos por segundo) sobre a freqüência espontânea.
3. Os estímulos químicos e protocolo de estimulação
- Produtos químicos de alta pureza são usados. Um importante componente do feromônio da fêmea orangeworm umbigo, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal foi obtida a partir Bedoukian Research Inc, CT. Produtos químicos são diluídos, w / v, com vidro-hexano destilada para fazer soluções estoque de 10 diluições mcg / mL e decádico são feitas. Uma alíquota (10 mL) de um estímulo químico dissolvido em hexano é carregado em um filtro de papel Whatman strip (8x40 mm), o solvente é evaporado agitando por 10 s sob uma coifa ea faixa é colocada em um polipropileno 5 mL seringa (seringas BD, NJ) a partir do qual vários volumes são ejetados. Hexano sozinho e uma seringa vazia servir como controle.
- A preparação é realizada em uma corrente de ar umidificado entregues pelo controlador de estímulo Syntech (CS-55 modelo; Syntech, Alemanha) a 20 mL / sec para o qual um pulso de estímulo de 4 mL / s é adicionado para 500 ms. Sinais são captados por 10 s, 2 s de partida antes do início do pulso de estímulo. Preparação antenais é estimulado com 500 ms de pulso durante o qual ca. 2 mL do ar purificado a partir de uma seringa de 5 mL de polipropileno contendo o estímulo é adicionado para o fluxo de ar principal. Um intervalo de pelo menos 1 min ou mais, seguindo alta respostas, é permitido entre as estimulações.
4. Resultados representante
Antenas das mariposas restringido (Figura 1) estimuladas com componente feromônio feminino, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal gerar respostas a dose robusta dependente (Figura 2). Este componente principais feromônio também provoca dose-dependente respostas excitatórias de longo trichodea sensilla (Figura 3A), como exibido em vestígios de gravações única unidade (Figura 3B).
A Figura 1. Viva umbigo orangeworm traça contido e antena exposta
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Figura 2. Dose respostas dependentes EAG atingida em resposta a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, um componente importante feromônio feminino.
Figura 3. Sensilla trichoid no sexo masculino umbigo orangeworm traça responder a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal de uma forma dose-dependente. (A) da antena do macho umbigo orangeworm mariposa é multi-segmentada e cada segmento é adornado com um grande número de cabelo como estruturas, sensilla. A micrografia eletrônica de varredura, mostrando detalhes na inserção (barras de escala são 200 e 50 mM, respectivamente). (B) Extracelular única unidade de gravações de um sensillum trichoid.
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Discussion
Esse novo método desenvolvido para dominar um live umbigo traça orangeworm para medir sinais olfativos provou ser robusto e muito confiável. Empregamos rotineiramente este método para isolar e identificar atrativos romance a partir de substratos como hospedeiro natural amêndoas e pistache.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Apoiada por USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177, e Incorporação de Pesquisa Bedoukian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
