Summary
Sistemas olfativos de insectos proporcionan oportunidades únicas para el registro de olor inducida por las respuestas en las formas de electroantennograms (EAG) y las grabaciones individuales sensillum (SSR), que se resumen las respuestas de todas las neuronas del receptor odorante (ORNs), ubicado en la antena y de los alojados en individuales sensilla, respectivamente.
Abstract
Sistemas olfativos de insectos proporcionan oportunidades únicas para el registro de olor inducida por las respuestas en las formas de electroantennograms (EAG) y las grabaciones individuales sensillum (SSR), que se resumen las respuestas de todas las neuronas del receptor odorante (ORNs), ubicado en la antena y de los alojados en individuales sensilla, respectivamente. Estos enfoques han sido explotados para obtener una mejor comprensión de la comunicación química de insectos. Los estímulos identificados se pueden utilizar como atrayentes o repelentes en las estrategias de gestión de plagas de insectos.
Protocol
1. Los insectos
- La naranja ombligo, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) colonia en nuestro laboratorio se originó a partir de las polillas recogida de los almendros en Fresno, CA. Nuestra colonia de insectos se mantiene en el medio ambiente cámaras (Percival Inc, IA) a 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% de humedad relativa, y en 16:8 h (luz: oscuridad) photo régimen.
- Polillas emergentes se recogen diariamente, sexo, y se transfieren a cajas de plástico (669 ml caja de almuerzo, 13 x 13 cm, la altura, 4,5 cm, Rubbermaid), siempre con un máximo de 10 capas de toallas de papel empapado de agua (Sed ultra absorbentes, 27,9 x 27,9 cm ; Safeway). Cubiertas de la caja están perforadas para permitir la circulación del aire. Esta disposición proporciona ~ 100% RH.
- Para las mediciones electrofisiológicas usamos 2-4 días polillas de edad después de la emergencia, que se mantienen en condiciones de humedad alta.
2. Preparación electrofisiológicos
- Polillas (hombres o mujeres) se presiona suavemente en una punta de la pipeta (200 l, EE.UU. Scientific Inc) que se corta de la parte superior de tener un diámetro de la punta grande (aprox. 2 mm). Una polilla se empuja suavemente a través del otro extremo con un trozo de papel de seda humidificado hasta las antenas y parte de la cabeza sobresalga de la punta.
- Cabeza expuesta es inmovilizado por cubrirse la cabeza con una arcilla que no reseca (Claytoon, Van Aken Internacional, CA), dejando una pequeña parte de uno de los ojos y dos antenas expuestos. Esta preparación se coloca sobre una plataforma de la Micromanipulador EAG MP-12 (Syntech, Alemania) entre las dos pinzas de soldadura.
- Usamos electrodo de vidrio a partir de 1,0 mm de borosilicato tubo capilar con filamento (WPI Inc, FL) y sacó en un modelo P-97 micropipeta extractor (Sutter Instruments, CA) para obtener microelectrodos de menos de un micrómetro de punta. Los electrodos son de nuevo lleno de sensillum linfáticos del timbre (Kaissling y Thorson, 1980). Un electrodo empala a la superficie expuesta del ojo bajo el microscopio (Leica MZ75) y sirve de referencia, mientras que el electrodo de registro acomoda las dos antenas. Para facilitar el contacto, distal segmentos antenales 1-2 se cortan antes de ser insertado en el electrodo de registro. Para las señales de las grabaciones de sensilla individual, modificar ligeramente la configuración en la que el electrodo de registro se clavado bajo el microscopio (Olympus BX51WI, 800x aumentos). Los potenciales de acción se registran mediante la inserción del electrodo de vidrio en la base de un sensillum. Las señales son amplificadas por una impedancia alta pre-amplificador (Syntech, Alemania) y se introduce en una UB-IDAC para ser analizados fuera de línea con AUTOSPIKE software (Syntech, Alemania). Señales de corriente alterna son de paso de banda filtrada entre 100 -10 000 Hz y los potenciales de acción son extraídos por ordenador mediante un algoritmo AUTOSPIKE que distingue a su punto máximo y el mínimo amplitudes del ruido. Las respuestas de las neuronas individuales se calculan como el aumento (o disminución) en la frecuencia del potencial de acción (picos por segundo) a través de la frecuencia espontánea.
3. Los estímulos químicos y protocolo de estimulación
- Productos químicos de alta pureza se utilizan. Un componente importante de la mezcla de feromona femenina de la naranja ombligo, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal se obtuvo de Bedoukian Research Inc, CT. Productos químicos se diluyen, w / v, con vidrio destilada hexano para que las soluciones de archivo de 10 diluciones mg / l, y se hacen decimal. Una alícuota (10 l) de una sustancia química estímulo disuelto en hexano se carga en una tira de papel de filtro Whatman (8x40 mm), se evapora el disolvente agitando suavemente durante 10 s en una campana de humos y la tira se coloca en una de polipropileno de 5 ml jeringa (jeringas BD, NJ) de varios volúmenes que son expulsados. Hexano solo y una jeringa vacía servir como control.
- La preparación se lleva a cabo en una corriente de aire húmedo emitido por el controlador de estímulo Syntech (CS-55 modelo; Syntech, Alemania) a 20 ml / seg a la que un pulso de estímulo de 4 ml / s, se añade a 500 ms. Las señales se registraron durante 10 s, a partir de 2 s antes de la aparición del pulso de estímulo. Preparación de las antenas se estimula con 500 ms de pulso durante el cual ca. 2 ml de aire purificado a partir de una jeringa de polipropileno de 5 ml que contienen el estímulo añadido en el flujo principal de aire. A diferencia de al menos 1 minuto o más, a raíz de las respuestas de alta, se permite entre los estímulos.
4. Resultados representante
Las antenas de las polillas restringido (Figura 1) estimuladas con componentes de feromona femenina, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal generar respuestas sólidas dependiente de la dosis (Figura 2). Este componente de feromonas también provoca grandes dosis de excitación depende de las respuestas a largo sensilla trichodea (Figura 3) como se muestra en los rastros de las grabaciones de una sola unidad (Figura 3B).
Figura 1. Vivo naranja ombligo polilla restringido y la antena expuestos
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Figura 2. Respuestas dosis-dependiente EAG provocado en respuesta a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, un componente importante de feromonas femeninas.
Figura 3. Trichoid sensilla en los hombres la naranja ombligo polilla responde a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal en una forma dependiente de dosis. (A) de la antena macho naranja ombligo polilla es de varios segmentos y cada segmento está adornado con una gran cantidad de pelo como las estructuras, sensilla. Una micrografía electrónica de barrido, que muestra los detalles en el recuadro (barras de escala son 200 y 50 M, respectivamente). (B) extracelular sola unidad-las grabaciones de una sensillum trichoid.
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Discussion
Este nuevo método desarrollado para la inmovilización de un ombligo en directo la polilla de la naranja para medir las señales olfativas ha demostrado ser sólido y muy fiable. Nosotros habitualmente utilizan este método para el aislamiento y la identificación de atrayentes novela a partir de sustratos huésped natural como las almendras y los pistachos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Con el apoyo de USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177, e incorporación Bedoukian investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
