Summary
Insect olfaktorischen Systeme bieten einzigartige Möglichkeiten für die Aufnahme Riechstoff-induzierten Reaktionen in den Formen der Elektroantennogramme (EAG) und Single Sensillum Aufnahmen (SSR), die Antworten zusammengefasst sind von allen Geruchsrezeptor Neuronen (ORNs) an der Antenne befindet und von denen in einzelnen untergebracht Sensillen, jeweils.
Abstract
Insect olfaktorischen Systeme bieten einzigartige Möglichkeiten für die Aufnahme Riechstoff-induzierten Reaktionen in den Formen der Elektroantennogramme (EAG) und Single Sensillum Aufnahmen (SSR), die Antworten zusammengefasst sind von allen Geruchsrezeptor Neuronen (ORNs) an der Antenne befindet und von denen in einzelnen untergebracht Sensillen, jeweils. Diese Ansätze wurden für ein besseres Verständnis von Insekten chemische Kommunikation genutzt. Die identifizierten Stimuli kann dann entweder als Lockmittel oder Repellents in Managementstrategien für Schadinsekten eingesetzt werden.
Protocol
1. Insekten
- Navel orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) Kolonie in unserem Labor von Motten aus Mandelbäume in Fresno, CA gesammelt entstanden. Unsere Insekten Kolonie ist in Klimakammern (Percival Inc, IA) bei 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% relative Luftfeuchtigkeit, und unter 16.08 h (Licht: dunkel) Foto-Regimes.
- Aufstrebende Motten werden täglich gesammelt sexed, und an Kunststoffboxen (669 mL Lunchbox, 13 x 13 cm, Höhe, 4,5 cm, Rubbermaid) versehen mit bis zu 10 Schichten von Wasser eingeweicht Papierhandtücher (Thirsty Ultra-saugfähige, 27,9 x 27,9 cm ; Safeway). Box umfasst sind perforiert, um die Luftzirkulation zu ermöglichen. Diese Anordnung bietet ~ 100% RH.
- Für elektrophysiologische Messungen verwenden wir 2-4 Tage alten Motten nach dem Auflaufen, die unter hoher Luftfeuchtigkeit gehalten werden.
2. Elektrophysiologische Vorbereitung
- Moths (männliche oder weibliche) werden sanft in eine Pipettenspitze (200 ul, USA Scientific Inc), die von oben geschnitten wird, um eine große (ca. 2 mm) Spitze Durchmesser haben geschoben. Eine Motte wird sanft durch das andere Ende mit einem befeuchteten Papiertuch Stub geschoben, bis die Antennen und einen Teil des Kopfes von der Spitze herausragen.
- Exposed Kopf wird durch das Bedecken des Kopfes mit einem nicht trocknenden Ton (Claytoon, Van Aken International, CA) verlässt ein kleiner Teil eines Auges und zwei Antennen ausgesetzt immobilisiert. Dieses Präparat ist auf einer Plattform des EAG Micromanipulator MP-12 (Syntech, Deutschland) zwischen den beiden Elektrodenhalter platziert.
- Wir verwenden Glaselektrode von 1,0 mm Borosilikatglas Kapillarrohr mit Filament (WPI Inc, FL) hergestellt und zog in einem Modell P-97 Mikropipette Puller (Sutter Instruments, CA) auf Mikroelektroden von weniger als einem Mikrometer Spitze zu erhalten. Die Elektroden sind zurück mit Sensillum Lymphe ringer (Kaissling und Thorson 1980) gefüllt. Eine Elektrode spießt den exponierten Bereich des Auges unter dem Mikroskop (Leica MZ75) und dient als Referenz, während die Aufzeichnung Elektrode nimmt die beiden Antennen. Zur Erleichterung der Kontaktaufnahme sind distal 1-2 Fühlerglied Segmente, bevor sie in die Aufnahme-Elektrode eingesetzt geschnitten. Für Aufnahmen Signale von einzelnen Sensillen wir etwas ändern diese Einstellung, wobei die Aufnahme Elektrode unter dem Mikroskop (Olympus BX51WI; 800x Vergrößerung) ist aufgespießt. Aktionspotenziale werden durch Einfügen der Glaselektrode an der Basis eines Sensillum aufgezeichnet. Die Signale werden durch eine hohe Impedanz-Vorverstärker (Syntech, Deutschland) und in einen UB-IDAC analysiert werden off-line mit AUTOSPIKE Software (Syntech, Deutschland) amplifiziert. AC-Signale werden Bandpass zwischen 100 -10000 Hz und Aktionspotentiale gefiltert werden per Computer mit einem AUTOSPIKE Algorithmus, der die peak-to-Trough-Amplituden unterscheidet sich von Lärm extrahiert. Responses von einzelnen Neuronen werden als die Zunahme (oder Abnahme) der Aktionspotential-Frequenz (Spikes pro Sekunde) über die spontane Frequenz berechnet.
3. Chemische Reize und Stimulation Protocol
- Chemikalien von höchster Reinheit eingesetzt werden. Ein wesentlicher Bestandteil der weiblichen Pheromon Mischung aus dem Nabel orangeworm, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal wurde von Bedoukian Research Inc, CT erhalten. Chemicals verdünnt sind, w / v, mit Glas-destilliertem Hexan Stammlösungen von 10 ug / ul und dekadischen Verdünnungen machen gemacht. Ein Aliquot (10 l) eines Reizes Chemikalie in Hexan gelöst auf ein Whatman-Filterpapier Streifen (8x40 mm) eingelegt ist, wird das Lösungsmittel durch leichtes Schütteln für 10 s unter einer Abzugshaube verdampft und der Streifen ist in einem 5 mL Polypropylen platziert Spritze (BD Spritzen, NJ), aus dem verschiedene Mengen ausgestoßen werden. Hexan allein und eine leere Spritze dienen als Kontrolle.
- Die Zubereitung ist in einem befeuchteten Luftstrom durch die Syntech Stimulus-Controller (CS-55-Modell; Syntech, Deutschland) geliefert statt bei 20 ml / sec, zu dem ein Reiz Puls 4 ml / s für 500 ms hinzugefügt wird. Die Signale werden für 10 s aufgezeichnet, beginnend 2 s vor dem Beginn des Stimulus Puls. Fühlerglied Vorbereitung wird mit 500 ms Puls, während der ca. stimuliert. 2 mL der gereinigten Luft aus einem 5 mL Polypropylen-Spritze mit der Reiz auf die Hauptstraße Luftstrom aufgenommen. Ein Abstand von mindestens 1 min oder mehr, nach hohen Antworten wird zwischen Stimulationen erlaubt.
4. Repräsentative Ergebnisse
Antennen verhalten Motten (Abbildung 1) mit weiblichen Pheromon-Komponente stimuliert, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal erzeugen robust dosisabhängige Reaktionen (Abbildung 2). Diese große Pheromon-Komponente auch entlockt dosisabhängig exzitatorische Antworten von langen trichodea Sensillen (Abb. 3A) als in Spuren Einheit Aufnahmen (Abbildung 3B) angezeigt.
Abbildung 1. Live Nabel orangeworm Motte zurückhaltend und Antenne exponierte
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Abbildung 2. Dosisabhängige EAG hervorgerufenen Reaktionen als Antwort auf (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, eine große weibliche Pheromon Bestandteil.
Abbildung 3. Sensillen trichoid bei männlichen Nabel orangeworm Motte zu reagieren (Z, Z) -11,13-hexadecadienal in einer dosisabhängigen Weise. (A)-Antenne der männlichen Nabel orangeworm Motte ist Multi-segmentiert und jedes Segment ist mit einer großen Anzahl von Haaren wie Strukturen, Sensillen geschmückt. Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, die Details im Einschub (Scale Bars sind 200 und 50 pM bzw.). (B) Extrazelluläre Single-Unit-Aufnahmen von einer trichoid Sensillum.
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Discussion
Dieses neuartige Verfahren für die Fesselung von einer Live-Nabel orangeworm Motte olfaktorischen Signale zu messen entwickelt hat sich als robust und sehr zuverlässig. Wir setzen routinemäßig diese Methode zur Isolierung und Identifizierung neuartiger Lockstoffe aus natürlichen Wirt Substraten wie Mandeln und Pistazien.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt durch USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177 und Bedoukian Forschung Incorporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
