Enregistrements à partir de cellules entières du cerveau d'adulte drosophile

Summary

Cette vidéo montre la procédure pour isoler cerveaux entiers de l'adulte de drosophile en préparation pour l'enregistrement à partir de neurones unique en utilisant la technologie standard de cellules entières. Il comporte des images de cellules GFP étiqueté et les neurones considérés lors de l'enregistrement.

Abstract

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure pour isoler cerveaux entiers de l'adulte de drosophile en préparation pour l'enregistrement de neurones isolés. Nous commençons par décrire la solution dissection et la capture des femelles adultes utilisés dans nos études. La procédure pour enlever tout le cerveau intact, y compris les deux lobes optiques, est illustrée. Dissection de la trachée recouvrant est également représentée. Le cerveau isolé est non seulement faible mais a besoin de soins spéciaux dans la manipulation à ce stade pour éviter d'endommager les neurones, dont beaucoup sont proches de la surface externe du tissu. Nous montrons comment un support spécial, nous avons développé est utilisé pour stabiliser le cerveau dans la chambre d'enregistrement. Un électrophysiologie installation standard est utilisé pour l'enregistrement à partir de neurones simples ou des paires de neurones. Une image fluorescente, vus au microscope d'enregistrement, d'une ligne de conduite GAL4 expression de la GFP (GH146) illustre comment les neurones de projection (PN) sont identifiés dans le cerveau vivant. Une grande puissance d'image Nomarski montre une vue d'un seul neurone qui est ciblé pour l'enregistrement de la cellule entière. Quand le cerveau est enlevé avec succès, sans dommages, la majorité des neurones sont spontanément actifs, le tir des potentiels d'action et / ou présentant spontanément entrée synaptique. Cette préparation in situ, dans lequel l'enregistrement de cellules entières de neurones identifiés dans l'ensemble du cerveau peut être combiné avec les manipulations génétiques et pharmacologiques, est un modèle utile pour explorer la physiologie cellulaire et la plasticité du système nerveux central adulte.

Protocol

Dissection I. de cerveaux de mouche adulte

1. Placer une petite goutte (~ 100 pi) de disséquer solution dans le centre d'un plat de Pétri de 35 mm.
2. Catch femelle adulte à l'aide aspirateur. Sous loupe binoculaire, utiliser deux aiguilles de seringue à décapiter la volée.
3. Placez la tête dans une petite goutte de solution saline dissection (avec de la papaïne ajoutée) dans une boîte de Pétri.
4. Position de la tête avec avec proboscis face fond du plat.
5. Tenez la cuticule qui couvre l'œil composé gauche avec l'aiguille 1. Faire une coupe en diagonale qui s'étend de la dorsale à la surface ventrale avec une aiguille 2, juste en dedans de l'aiguille 1.
6. Tenez les pièces buccales avec aiguille 1 et 2 l'utilisation de seringues pour faire une coupe horizontale qui s'étend de la surface ventrale de l'œil gauche à l'œil droit, au niveau de la base de trompe.
7. Tenez la cuticule qui couvre l'œil composé à droite avec l'aiguille 1. Faire une coupe en diagonale qui s'étend de la dorsale à la surface ventrale avec une aiguille 2, juste médiale de l'aiguille 1.
8. Tournez la tête de sorte que le côté rostrale est à la surface une boîte de Pétri. Insérez l'aiguille 1, entre la cuticule rostrale et le cerveau, et l'utilisation d'aiguilles de 2 à suivre le même chemin que la première aiguille. Idéalement, la capsule sera décoller du cerveau avec les deux lobes optiques attachés car ils sont important dans la stabilisation du cerveau pour l'enregistrement.
9. La trachée, sacs aériens, et d'autres tissus conjonctifs sont soigneusement enlevé en utilisant deux pinces à pointe fine.
10. Dissection entier devrait prendre 3-10 minutes

II. Montage du SNC

1. Le cerveau est transféré à la chambre d'enregistrement à l'aide d'une pipette extrémité jaune.
2. Dans la chambre d'enregistrement, le cerveau est stabilisé en plaçant le cadre de platine tels que les deux réticules de beaux prendre contact avec le tissu à la jonction entre les lobes optiques et de la région du cerveau central.
3. Chaque cerveau est autorisé à se reposer dans la chambre d'enregistrement avec une perfusion continue avec une solution saline oxygénée (95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5%) pendant au moins 10 minutes. Perfusion de la chambre avec une solution saline oxygénée est poursuivie pendant toute la période d'enregistrement. La préparation est visualisée en utilisant un microscope droit (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Allemagne) avec une scène fixe et un objectif 40x d'eau par immersion (Achroplan; ouverture numérique, 0,8; Zeiss) et de l'optique Nomarski. GFP a été vu avec un filtre BP 505-530 fluorescence.

III. Électrophysiologie

1. Pipettes de 8-14 Mohms sont utilisés pour les enregistrements de cellules entières
2. Enregistrements de courant pince et voltage-clamp sont effectuées en utilisant une liste ou un amplificateur EPC7 Axopatch 200B, une Digidata 1322A convertisseur DA (Molecular Devices, Foster City, CA), un Dell Dimension 8200 ordinateur (Dell Computer, Round Rock, TX), et pClamp 9 logiciels (Molecular Devices).

Discussion

La préparation du cerveau isolés ensemble, nous illustrer dans cette vidéo permet une évaluation des mécanismes cellulaires qui sous-tendent l'excitabilité et la transmission synaptique dans les neurones identifiés, y compris ceux dans les voies de traitement olfactif, dans le cerveau adulte chez la drosophile (Gu et O Dowd, 2006). Cette approche est complémentaire à l'étude de l'activité neuronale dans le cerveau des adultes intacts Drosophila (Wilson et tous en 2004), dans une grande partie de la même manière à partir des enregistrements de neurones dans une tranche de cerveau des mammifères sont complémentaires aux enregistrements en éveil les mammifères se comporter. Il ya deux avantages majeurs de la volée dans la préparation du cerveau in situ par rapport aux tranches de mammifères. D'abord le cerveau volent ensemble s'intègre facilement dans la chambre d'enregistrement de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'accise un petit morceau de tissu provenant d'un grand circuit neuronal qui survient lors de tranches de cerveau de mammifères. Par conséquent, les circuits neuronaux dans le cerveau restent isolés Drospohila largement intact. Deuxièmement, les corps cellulaires de la plupart des neurones sont à proximité de la surface du cerveau, facilement accessible pour l'enregistrement de la cellule entière et ils restent fonctionnellement actif lorsque perfusée en continu avec une solution saline oxygénée pendant plusieurs heures.

En utilisant une chambre d'enregistrement à fond de verre permet aussi l'identification des neurones spécifiques sur la base de leur localisation et / ou expression de la GFP. Dans cette préparation, l'enregistrement pendant la perfusion est nécessaire de stabiliser le cerveau. Ce n'est pas compatible avec les procédures standard, y compris les fils d'or stratégiquement placés ou filet de nylon, qui sont efficaces pour les tissus tels que des coupes d'hippocampe, en raison de la faible taille de l'ensemble du cerveau (~ 1mm). C'est pourquoi nous un support conçu avec un châssis de platine et de réticule de nylon positionnées à communiquer avec le cerveau en seulement deux endroits pour minimiser les dommages aux neurones situés à proximité de la surface du cerveau. Cela stabilise le cerveau, soit avec la face antérieure ou postérieure vers le haut et la surface opposée simplement légère reposant sur le plancher de la chambre d'enregistrement. En utilisant ce dispositif, nous sommes en mesure de maintenir la stabilité des enregistrements régulièrement cellules entières jusqu'à une heure, même de petits neurones dont les cellules de Kenyon, tout en faisant des manipulations pharmacologiques qui exigent l'application de bain de médicaments spécifiques. Le titulaire doit également être utile dans la sécurisation d'autres petits échantillons de tissu pour les études électrophysiologiques tels que des tranches de la moelle épinière des rongeurs nouveau-nés.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices