Summary
Questo video mostra la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione di singoli neuroni utilizzando tecnologia standard a cellula intera. Esso comprende le immagini di cellule GFP etichettati e neuroni visualizzati durante la registrazione.
Abstract
In questo video, dimostriamo la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione da singoli neuroni. Cominciamo con la descrizione della soluzione di dissezione e la cattura delle femmine adulte utilizzate nei nostri studi. La procedura per la rimozione del cervello intatto, tra cui entrambi i lobi ottici, è illustrata. Dissezione della trachea sovrastante è anche mostrato. Il cervello isolato non è solo piccola ma necessita di particolare attenzione nella gestione in questa fase, per evitare di danneggiare i neuroni, molti dei quali sono vicini alla superficie esterna del tessuto. Si mostra come un supporto speciale che abbiamo sviluppato è usato per stabilizzare il cervello nella camera di registrazione. Un elettrofisiologia norme stabilite viene utilizzato per la registrazione di singoli neuroni o coppie di neuroni. Una immagine fluorescente, vista attraverso il microscopio di registrazione, da una linea guida GAL4 espressione GFP (GH146) illustra come i neuroni di proiezione (PN) sono identificate nel cervello vivo. Una immagine ad alta potenza Nomarski mostra una vista di un singolo neurone che è nel mirino per la registrazione a cellula intera. Quando il cervello è rimosso con successo senza danni, la maggior parte dei neuroni sono attivi spontaneamente, sparando potenziali d'azione e / o esporre spontaneo di input sinaptici. Questo in preparazione in situ, in cui la registrazione a cellule intere di neuroni identificati in tutto il cervello può essere combinato con manipolazioni genetiche e farmacologiche, è un modello utile per esplorare la fisiologia cellulare e la plasticità del sistema nervoso centrale adulto.
Protocol
I. La dissezione del cervello da mosca adulta
- Mettere una piccola goccia (~ 100 l) di dissezione soluzione in centro di un piatto 35 millimetri Petri.
- Cattura femmina adulta con aspiratore. Sotto dissezione microscopio, utilizzare due aghi da siringa di decapitare la mosca.
- Mettere la testa in una piccola goccia di soluzione salina dissezione (con papaina aggiunto) in una capsula di Petri.
- Testa di posizione con con proboscide rivolta fondo del piatto.
- Tenere la cuticola che copre l'occhio sinistro composto con ago 1. Fare un taglio diagonale che si estende dalla dorsale verso la superficie ventrale con ago 2, proprio mediale ago 1.
- Tenere l'apparato boccale con l'ago 1 e usare l'ago 2 per fare un taglio orizzontale che si estende dalla superficie ventrale dell'occhio sinistro per l'occhio destro, a livello della base della proboscide.
- Tenere la cuticola che copre l'occhio destro compound con ago 1. Fare un taglio diagonale che si estende dalla dorsale verso la superficie ventrale con ago 2, proprio mediale dell'ago 1.
- Ruotare la testa in modo che la parte rostrale è sulla superficie del piatto di Petri. Inserire l'ago 1 tra la cuticola rostrale e il cervello, e usare l'ago da 2 a seguire lo stesso percorso del primo ago. Idealmente, la capsula sarà staccarsi dal cervello con entrambi i lobi ottici collegati in quanto questi sono importanti per stabilizzare il cervello per la registrazione.
- La trachea, l'aria sacche, e altri tessuti connettivi sono accuratamente rimossi con due pinze punta fine.
- Dissezione tutto dovrebbe prendere 3-10 minuti
II. Montaggio del sistema nervoso centrale
- Il cervello è trasferita nella camera di registrazione usando una pipetta gialla punta.
- Nella camera di registrazione, il cervello è stabilizzato posizionando il telaio platino tale che due mirino bene mettersi in contatto con il tessuto a livello della giunzione tra i lobi ottici e la regione del cervello centrale.
- Ogni cervello si lascia riposare in camera di registrazione con perfusione continua con soluzione fisiologica ossigenata (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) per almeno 10 minuti. Perfusione della camera con soluzione fisiologica ossigenata è proseguito per tutto il periodo di registrazione. La preparazione è visualizzata utilizzando un microscopio in posizione verticale (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Germania) con un palco fisso e un obiettivo 40x immersione in acqua (Achroplan, apertura numerica, 0,8; Zeiss) e l'ottica Nomarski. GFP è stato visto con una pressione arteriosa 505-530 fluorescenza filtro.
III. Elettrofisiologia
- Pipette di 8-14 Mohm sono usati per le registrazioni a cellula intera
- Current-clamp e voltage-clamp registrazioni vengono eseguite utilizzando un elenco EPC7 o un amplificatore Axopatch 200B, un Digidata 1322A convertitore DA (Molecular Devices, Foster City, CA), un Dell Dimension 8200 computer (Dell Computer, Round Rock, TX), e pClamp 9 software (Molecular Devices).
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Discussion
La preparazione isolato intero cervello illustriamo in questo video permette la valutazione dei meccanismi cellulari alla base eccitabilità e la trasmissione sinaptica nei neuroni identificati, compresi quelli nelle vie di elaborazione olfattiva, nel cervello adulto Drosophila (Gu e O Dowd, 2006). Questo approccio è complementare allo studio dell'attività neuronale nel cervello degli adulti Drosophila intatto (Wilson et all 2004), più o meno allo stesso modo le registrazioni da parte dei neuroni in una fetta cervello dei mammiferi sono complementari alle registrazioni in sveglio mammiferi comportarsi. Ci sono due vantaggi principali della preparazione in situ cervello volare rispetto al fette mammiferi. In primo luogo il cervello volare tutto si adatta facilmente nella camera di registrazione in modo non è necessario ad accisa un piccolo pezzo di tessuto da un circuito più ampio neurale che si verifica quando si effettua fettine di cervello dei mammiferi. Pertanto i circuiti neuronali all'interno del cervello isolato Drospohila rimangono in gran parte intatta. In secondo luogo, i corpi cellulari della maggior parte dei neuroni sono vicino alla superficie del cervello, facilmente accessibili per la registrazione di cellule intere e rimangono attivi quando funzionalmente continuamente perfuso con soluzione fisiologica ossigenata per diverse ore.
Utilizzando un fondo di vetro camera di registrazione consente anche l'identificazione dei neuroni specifici sulla base della loro posizione e / o espressione GFP. In questa preparazione, registrazione durante la perfusione richiede la stabilizzazione del cervello. Questo non è compatibile con le procedure standard, tra cui filo d'oro in posizione strategica o mesh di nylon, che sono efficaci per tessuti come fettine di ippocampo, a causa delle dimensioni ridotte del cervello intero (~ 1mm). Quindi abbiamo un supporto progettato con un telaio di platino e mirino in nylon posizionato a contattare il cervello in sole due posizioni per minimizzare i danni ai neuroni situati vicino alla superficie del cervello. Questo stabilizza il cervello, sia con la superficie anteriore o posteriore rivolto verso l'alto e la superficie opposta solo leggermente appoggiato sul pavimento della camera di registrazione. L'utilizzo di questo dispositivo siamo in grado di mantenere stabili le registrazioni di routine cellula intera per un massimo di un'ora, anche da piccoli neuroni comprese le cellule Kenyon, mentre si fa manipolazioni farmacologiche che richiedono l'applicazione bagno di farmaci specifici. Il titolare dovrebbe essere utile anche per garantire altri piccoli campioni di tessuto per studi elettrofisiologici, come le fette del midollo spinale di roditori neonatale.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH NS27501 DKOD. Supporto aggiuntivo per questo lavoro è stato fornito da una sovvenzione HHMI Programma Professore a DKOD.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Foceps | Tool | Fine Science Tools | No. 11251-10 | Be careful, never damage the fine tips of forceps |
| Papain | Reagent | Worthington Biochemical | 3126 | 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine |
| Dissecting microscope | SMZ-2B Model:C-PS | Nikon Instruments | Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle | |
| Needle & Syringe | PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co | 305175 & 309602 | Cheap and durable | |
| Upright microscope | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp | |
| Patch clamp amplifier | 200 B | Molecular Devices | ||
| Digidata D-A converter | 1322A | Molecular Devices |
References
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
