Summary
이 비디오는 표준 전체 세포 기술을 사용하여 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 그것은 녹음하는 동안 많이 GFP 라벨 세포와 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 우리는 해부 솔루션 및 우리의 연구에 사용되는 성인 여성의 캡처를 설명하여 시작합니다. 두 광 엽 (叶)을 포함하여 전체 두뇌 손상 제거하는 절차는 그림입니다. overlying의 기관의 해부도 표시됩니다. 고립된 두뇌는 작은뿐만 아니라하지만 뉴런의 손상을 방지하려면이 단계에서 취급에 특별한주의가 필요하는 많은 조직의 외부 표면 가까이에 있습니다. 우리가 개발한 특별한 소유자가 기록 챔버의 머리를 안정화하는 데 사용됩니다 방법을 보여줍니다. 표준 전기 생리학 최대가 뉴런의 단일 뉴런 또는 쌍의 기록에 사용됩니다 설정할 수 있습니다. (GH146) 프로젝션 뉴런 (PNS)가 살아있는 두뇌에 식별하는 방법을 보여줍니다 GFP 표현 운전 GAL4 라인에서 녹음 현미경을 통해 본 형광 이미지. 고전력 Nomarski 이미지는 전체 세포 녹음 대상으로되고 단일 신경 세포의보기를 표시합니다. 두뇌가 성공적으로 손상없이 제거되면, 뉴런의 대부분은 작업 잠재력 및 / 해고 또는 자발적인 시냅스 입력을 전시, 자발적으로 활성화됩니다. 전체 뇌 뉴런에서 확인된 전체 휴대폰 녹음이 유전 및 약리 조작과 조합하여 사용할 수있는 현장 준비에 이것은 성인 CNS의 세포 생리와 소성을 탐험에 유용한 모델입니다.
Protocol
성인 파리에서 두뇌의 I.의 해부
- 35mm 페트리 접시의 중앙에 솔루션을 해부의 작은 방울 (~ 100 μl)을 놓으십시오.
- 흡인기를 사용하여 성인 여성을 관람해보세요. 현미경을 해부에서 날아 목을 벨 두 주사기의 바늘을 사용합니다.
- 배양 접시에있는 해부 생리의 작은 방울 (papain가 추가로)에 플레이스 머리.
- 접시의 바닥을 마주 코와 함께 위치 머리.
- 바늘 1 왼쪽 화합물 눈을 덮고있는 표피를 잡아. 바늘 1 단지 중간 바늘 2와 복부 표면에 지느러미에서 확장하는 대각선 절단하십시오.
- 바늘 1 mouthparts 잡고 코의 기지의 수준, 오른쪽 눈 왼쪽 눈의 복부 표면에서 확장 수평 절단을하기 위해 바늘이 2를 사용합니다.
- 바늘 1 오른쪽 화합물 눈을 덮고있는 표피를 잡아. 바늘 1 단지 중간 바늘 2와 복부 표면에 지느러미에서 확장하는 대각선 절단하십시오.
- 주동이의 측면은 페트리 접시의 표면에 수 있도록 머리를 회전합니다. 주동이의 표피와 뇌 사이의 바늘 1을 삽입하고, 첫 번째 바늘과 같은 경로를 따라 바늘이 2를 사용합니다. 이상적으로, 캡슐은 레코딩을위한 두뇌 안정화에 중요한 떨어진이 때문에 연결된 두 광 엽 (叶)으로 두뇌의 껍질됩니다.
- 기관, 공기 주머 니나, 기타 결합 조직은 신중하게이 멋진 팁 집게를 사용하여 제거됩니다.
- 전체 해부는 30~10분을 취하
II. CNS를 장착
- 두뇌는 노란색 팁 pipet을 사용하여 녹음 챔버로 전송됩니다.
- 레코딩 챔버에서 뇌의 두 고급 크로스 머리카락이 광 엽 (叶) 및 중앙 두뇌 지역 사이의 교차점에있는 조직과의 접촉을 이러한 플래티넘 프레임을 배치하여 안정화됩니다.
- 각각의 두뇌는 적어도 10 분 동안 산소 식염수에 지속적인 관류 (95 % 산소와 5 % 이산화탄소)와 녹화 실에서 휴식을 허용합니다. 산소 생리와 챔버의 재관류는 녹음 기간 내내 계속됩니다. 그리고 Nomarski 광학 고정된 무대와 40x 물 침지 목표 (;, 수치 조리개, 0.8 자이스 혈구 Achroplan)로, 준비는 직립 현미경 (자이스 혈구, Oberkochen, 독일 Axioskop 2FS)를 사용하여 시각입니다. GFP는 BP 505-530 형광 필터를 조회했다.
III. 전기 생리학
- 8-14 Mohms의 Pipets는 전체 세포 레코딩에 사용됩니다
- 전류 클램프 및 전압 - 클램프 녹음 목록 EPC7 또는 Axopatch 200B 증폭기, Digidata 1322A DA 컨버터 (분자 디바이스, 포스터 시티, CA), 델 디멘션 8200 컴퓨터를 (델 컴퓨터, 라운드 록, TX), 사용하고 수행됩니다 9 소프트웨어 (분자 장치) pClamp.
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Discussion
우리는이 동영상에서 보여주는 고립 전체 뇌 준비 흥분과 성인 Drosophila 두뇌 (특별시 및 O 다우드, 2006)에서 후각 처리 경로에 해당 포함한 식별 뉴런에서 신경 전달 기본 세포 메커니즘의 평가를하실 수 있습니다. 이 방법은 깨어있는 행동 포유류에서 녹음을 보완하는 포유류의 뇌 슬라이스의 뉴런에서 많은 동일한 방식으로 녹음에 손상 성인 Drosophila (윌슨 동부 표준시 모든 2004)의 두뇌에의 연결 활동 연구 보완합니다. 포유 동물 조각에 비해 현장 플라이 두뇌 준비의 두 가지 주요 장점이 있습니다. 그것이 엑사이스 포유류의 뇌 조각을 만들 때 발생하는 큰 신경 회로에서 조직의 작은 조각 필요는 없습니다 그래서 먼저 전체 플라이 두뇌 녹음이 챔버에 쉽게 맞출 수 있습니다. 따라서 절연 Drospohila의 두뇌 속에의 연결 회로는 대부분 그대로 남아있다. 둘째, 뉴런의 대부분의 세포 기관은 뇌 표면 근처의 전체 세포 녹음 쉽게 액세스할 수 있습니다 그들은 지속적으로 몇 시간 동안 산소를 식염수에 perfused 때 기능 활성 상태로 유지됩니다.
유리 바닥 기록 챔버를 사용하면 자신의 위치 및 / 또는 GFP 표현에 기초하여 특정 뉴런의 신분을 수 있습니다. 이 준비에서 재관류 동안 녹음을하면 두뇌의 안정화가 필요합니다. 이것은 전체 뇌 (~ 1mm)의 작은 크기로 인해 이러한 hippocampal 조각 같은 조직에 대한 효과적인 전략적으로 배치 골드 와이어 또는 나일론 메쉬를 포함하여 표준 절차,,,와 호환되지 않습니다. 따라서 우리 플래티넘 프레임과 두뇌의 표면 근처에있는 뉴런의 손상을 최소화하기 위해 두 지역의 뇌는에게 연락 위치 나일론 크로스 머리카락과 설계 홀더 (Holder). 이 중 최대 직면하고있는 앞쪽에 또는 후부 표면과 그냥 가볍게 기록 챔버의 바닥에 휴식 반대로 표면과 머리를 안정화. 이 장치를 사용하여 우리는 특정 약물 목욕 응용 프로그램을 필요로 약리 조작을하는 동안 일상적으로, 심지어 케년 세포를 포함하는 작은 뉴런에서 시간까지 안정 전체 셀 녹음을 유지할 수 있습니다. 홀더 또한 신생아 설치류에서 척수 조각으로 electrophysiological 연구 등의 작은 조직 샘플을 확보에 유용합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. 이 작품에 대한 추가 지원은 DKOD에 HHMI 교수 프로그램 권한 부여에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Foceps | Tool | Fine Science Tools | No. 11251-10 | Be careful, never damage the fine tips of forceps |
| Papain | Reagent | Worthington Biochemical | 3126 | 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine |
| Dissecting microscope | SMZ-2B Model:C-PS | Nikon Instruments | Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle | |
| Needle & Syringe | PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co | 305175 & 309602 | Cheap and durable | |
| Upright microscope | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp | |
| Patch clamp amplifier | 200 B | Molecular Devices | ||
| Digidata D-A converter | 1322A | Molecular Devices |
References
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
