इस प्रोटोकॉल में हम एक विधि के लिए उपाय मौजूद<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> उम्र 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में.
जीवन एक जैविक प्रक्रिया कई आनुवंशिक रास्ते के द्वारा विनियमित है. एक उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान की जांच की रणनीति के लिए जानवरों के अध्ययन है कि उम्र नियामक रास्ते के घटकों में बंदरगाह म्यूटेशनों. यदि इन म्यूटेशनों उम्र नियामक मार्ग के समारोह में उपद्रव और इसलिए पूरे जीव के जीवन को बदल, वे 1-3 महत्वपूर्ण यंत्रवादी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.
उम्र के नियमन की जांच के लिए एक रणनीति के लिए उपद्रव उम्र नियामक रास्ते छोटे अणुओं का उपयोग करने के लिए है. तिथि करने के लिए, अणुओं के एक नंबर करने के लिए विभिन्न मॉडल जीवों में उम्र बढ़ाने में जाना जाता है और औजार के रूप में इस्तेमाल किया 4-16 उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान का अध्ययन . पहचान अणुओं की संख्या इस प्रकार अब तक आनुवंशिक "toolset है कि उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध है की तुलना में छोटा है.
Caenorhabditis एलिगेंस एक सिद्धांत के लिए अपनी उत्कृष्ट आनुवंशिकी और तीन सप्ताह से कम उम्र की वजह से उम्र बढ़ने अध्ययन किया मॉडल है. हाल ही में, C.elegans phenotype आधारित अपने छोटे आकार और उसके microtiter प्लेट में विकसित करने की क्षमता की वजह से दवा 5,7,16-20 स्क्रीन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभरा है.
यहाँ हम 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों में C.elegans उम्र को मापने के लिए एक परख उपस्थित थे. परख विकसित किया गया था और सफलतापूर्वक अणुओं है कि C.elegans 7 उम्र बढ़ाने के लिए बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया. परख की विश्वसनीयता कई परीक्षणों में मूल्यांकन किया गया था: पहला, जंगली प्रकार अलग तापमान पर हो पशुओं की उम्र को मापने के द्वारा, दूसरा, बदल lifespans के साथ म्यूटेंट की उम्र को मापने के द्वारा, विभिन्न सांद्रता के जीवन में प्रतिक्रिया में परिवर्तन को मापने के द्वारा तीसरी, एंटी Mirtazepine. Mirtazepine पहले C.elegans 7 में उम्र बढ़ाने दिखाया गया है. इन परीक्षणों के परिणाम बताते हैं कि परख अन्य assays से पिछले निष्कर्षों को दोहराने में सक्षम है और मात्रात्मक है. microtiter प्रारूप भी इस उम्र परख स्वचालित तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ संगत करता है और स्वचालित प्लेटफार्मों में एकीकरण की अनुमति देता है है.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों में C.elegans उम्र की माप की अनुमति देता है. प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया अनुभाग यह मज़बूती से पिछले निष्कर्ष replicates और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है है. इस परख का उपयोग हम सफलतापूर्वक C.elegans जीवन पर उनके प्रभाव के लिए 89,000 अणुओं से अधिक जांच की.
दवा स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए, एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट प्रारूप में उम्र को मापने शास्त्रीय ठोस मीडिया परख पर कई फायदे हैं. यह मीडिया तैयारी, ऊष्मायन अंतरिक्ष की राशि है, और दवा की राशि की आवश्यकता के लिए आवश्यक श्रम को कम कर देता है. 96 अच्छी तरह प्रारूप और माइक्रोस्कोपी सेटअप उच्च throughput प्रदर्शन के लिए पूरे परख के स्वचालन की अनुमति देते हैं.
परख के विकास के दौरान प्रत्येक चर और संयोजन के लिए एकाधिक मानों उसके C.elegans जीवन पर उनके प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया. इन परीक्षणों अलग OP50 3 से 10 से लेकर एकाग्रता शामिल मिलीग्राम / एमएल (3, 4, 6, 8, 10 मिलीग्राम / एमएल), 7 से 45 (7, 10, 15, 22, 45 को लेकर अच्छी तरह से प्रति कीड़े के विभिन्न संख्या अच्छी तरह / कीड़े), अलग संस्कृति से 40 अच्छी तरह से 150 प्रति μL (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), और बफर संरचना में परिवर्तन को लेकर मात्रा. Carbenicillin प्रतिरोधी OP50 के साथ खिलाया यदि Carbenicillin न तो और न ही सांद्रता में Amphotericin बी ने संकेत दिया C.elegans जीवन को प्रभावित पाए गए. प्लेटों के सतत कोमल मिलाते हुए, जैसा कि अक्सर C.elegans तरल संस्कृति में सिफारिश की है, इस परख में प्रयुक्त छोटे संस्करणों के लिए अनावश्यक पाया गया था . कोमल मिलाते लेकिन अगर बड़े कुओं के साथ microtiter प्लेट के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं आवश्यक है. मूल्यों का संकेत दिया है इस प्रोटोकॉल में सावधानी से किया गया है विभिन्न परीक्षण शर्तों के सांख्यिकीय तुलना के आधार पर चयनित.
इस परख का सबसे आश्चर्यजनक विशेषता शायद तथ्य यह है कि C.elegans 96 अच्छी तरह प्लेटें कि टेप के साथ सील कर रहे हैं में रखा जा सकता है. पक्ष द्वारा साइड तुलना, एक प्लास्टिक की मुहर के साथ बंद प्लेटों में या sealers है कि हवा आदान – प्रदान की अनुमति के साथ बंद प्लेटों में unsealed प्लेटों में सुसंस्कृत जानवरों की उम्र में कोई फर्क नहीं प्रकट किया था,. सभी तीन स्थितियों में, जानवरों L1 से 65 घंटे के भीतर gravid वयस्कों के लिए बहुत homogenously विकसित और बहुत तुलनीय lifespans दिखाया. एन जी एम पर समानांतर में बड़े पशु के रूप में थोड़ा तेजी से विकसित की है, लेकिन इस अंतर या एक मुहर के अभाव की उपस्थिति के स्वतंत्र थी.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीवित बैक्टीरिया पर आधारित है, लेकिन मृत बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, एक तरल परख में एक एकल जीवित बैक्टीरिया जल्दी गुणा और संस्कृति को पुनः – पॉप्युलेट कर सकते हैं. हमारे हाथों में, केवल विश्वसनीय हद तक है कि वे तरल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीवाणुओं को मारने के लिए रास्ता गामा विकिरण के साथ बैक्टीरिया के लंबे समय तक इलाज से है.
एक महत्वपूर्ण बिंदु एक उम्र प्रयोग के नियोजन में विचार का पता लगाने की शक्ति है. प्रभाव के आकार पर निर्भर करता है, ब्याज की दवा के प्रभाव के कई कुओं में परीक्षण किया जाना चाहिए. एक ठेठ परख 4 दवा और इलाज 4 नियंत्रण कुओं, इसी के लिए मोटे तौर पर प्रत्येक 40-50 पशुओं में, प्रयोगों के 95% से अधिक में एक उम्र में 30% की वृद्धि का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. 14% की वृद्धि केवल मामलों के 60% में पाया जाता है और इसलिए अधिक को दोहराने के कुओं की आवश्यकता है.
उम्र के इस परख द्वारा उत्पन्न डेटा के धन प्रयोग करने के लिए विकसित करने के लिए या विशिष्ट parametrical Gompertz एक मॉडल तनाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये Gompertz मॉडल पता लगाने की शक्ति का निर्धारण करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए झूठी सकारात्मक और नकारात्मक की संख्या का अनुमान करने के लिए उपयोगी होते हैं. हम अंधा प्रयोगों में इन मॉडलों की भविष्यवाणी की पुष्टि और उन्हें इस्तेमाल करने के लिए बड़े परदे में झूठी नकारात्मक की संख्या (अप्रकाशित परिणाम) का अनुमान है.
संक्षेप में, हम आशा है कि प्रस्तुत परख महान उपयोग करने के लिए छोटे अणुओं है कि C.elegans की उम्र बढ़ाने और अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने की पहचान के हो जाएगा.
The authors have nothing to disclose.
यह प्रोटोकॉल मूल Xiaolan सुनो और माइकल Petrascheck द्वारा किया गया फ्रेड हचिंसन कैंसर रिसर्च सेंटर में सिएटल में लिंडा बक की प्रयोगशाला में विकसित किया है. ऊपर विस्तृत संस्करण में संपूर्ण प्रक्रिया व्यापक समुदाय के लिए उपलब्ध बनाने के लिए तैयार किया गया है. हम गंभीर प्रोटोकॉल पढ़ने के लिए कैरोल टेलर, सारा LeBoeuf और एंडी Tomacelli धन्यवाद. यह स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से 2866 # पांडुलिपि है. Petrascheck लैब नोवार्टिस ADI प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित है.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone | |
FUDR | Sigma-aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water | |
Mianserin | Sigma-aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration | |
Cyproheptadine | Sigma-aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration | |
Sealing Tape | Nunc | cat# 236370 | Polyester, non-sterile | |
96 well plate | Falcon | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene | |
Nunclon flask | Nunc | cat# 178883 | used for large volumes |