Summary
协议描述获得一个膜蛋白，重组蛋白在油脂立方米阶段（LCP）起的晶体衍射的质量必不可少的步骤，寻找LCP - FRAP预结晶实验的初始条件，设立LCP的结晶试验和收获晶体。
Abstract
膜蛋白相关的信号传导，运输和能源的转换，正因为如此，在众多的故障和疾病有牵连的活细胞执行的关键功能。然而，强烈的膜蛋白的结构和功能的认识是落后可溶性伙伴，主要是由于与衍射晶体的溶解和代困难。油脂介孔结晶（又称观或LCP的结晶）是一种很有前途的技术成功地应用于获得微生物视紫质，光合蛋白，外膜的beta桶和G蛋白偶联受体的高分辨率结构。在中观的结晶，需要一个类似母语的膜环境的优势，通常会产生较低的溶剂含量和更好的排序相比，洗涤剂解决方案的传统结晶的晶体。该方法并不难，但需要了解脂质的相行为和处理粘性中间相材料的做法。在这里，我们展示了一个简单有效的方法，使LCP和改组使用注射器搅拌机，配药到一个试验或结晶板LCP的纳升的部分，进行预结晶实验，并从收割晶体的LCP脂质双层膜蛋白LCP的矩阵。这些协议提供了一个在中间的结晶试验临近的基本指导，但是，任何结晶实验，广泛的筛选和优化，并取得成功的结果并不一定保证。
Protocol
一个典型的轮廓观结晶实验是在图1,2所示。预结晶LCP - FRAP实验是可选的;但是，它们可以显着加快搜索初始结晶条件的过程中特别是在困难的膜蛋白3情况下，。
1。在LCP蛋白质重构
- 净化膜蛋白的洗涤剂溶液中的兴趣和集中的蛋白质/去污剂复合物〜10 - 20毫克/毫升，注意不要过度浓缩洗衣粉 1,4 。
- 转移一个LCP主机脂质（通常monoolein）或脂质混合物为1.5毫升塑料管和孵育40〜25毫克° C直到几分钟脂融化。
- 将100μL气密注射器注射器耦合。
- 将熔融使用音量可调移液器脂质注射器。记录在注射器中的脂质量。
- 一种蛋白质的解决方案，以脂质比2 / 3 V /蛋白质溶液装入另外100μL注射器诉
- 通过注射器耦合连接两个注射器。
- 推注射器活塞交替脂质和蛋白质，通过耦合器内针来回移动，直到脂质中间相变得均匀。 LCP的形式自发地机械搅拌后，在LCP的脂质双层重组蛋白质。 LCP的形成，可核实birefringency缺乏透明和凝胶体状的一致性和跨偏振片配备显微镜下观察时，或者，如果可能的话，用小角X - 射线衍射1。
2。 LCP - FRAP预结晶实验
LCP - FRAP分析是用来衡量膜蛋白的扩散性质在LCP重组的各种筛选条件3。在LCP膜蛋白的远距离扩散成功的结晶，是必不可少的;然而，LCP的微观结构，制约了大量的蛋白质或低聚蛋白质总量的扩散。 观结晶实验失败的一个常见的原因是一个快速的蛋白质聚集，导致亏损扩散。它已被证明的一种蛋白质的聚集行为取决于特定的蛋白质的构造，主机脂质和 3的筛选解决方案的组成。
- 标签用荧光染料（Cy3标记或类似）的100 / 1〜的蛋白/染料比率的蛋白质，除去未反应的染料和集中的蛋白质〜1毫克/毫升。标签无论是免费胺或免费硫醇。当标签自由胺，pH值7和7.5之间为主标签免费的N -末端。请注意氨基酸的标签也可以标签纯化蛋白质 2,3血脂。
- 重组在LCP在第1条所述的标记蛋白）。
- 设置检测板，在第3节所述）使用LCP - FRAP筛选解决方案，而不是结晶屏幕2。
- 孵育板块在20 ° C黑暗的至少12小时，以达到平衡状态环境中。
- LCP的FRAP站和第一次使用10倍的目标，重点放在板块之一。
- 掌握5荧光图像，捕捉到最初的预漂白状态。
- 触发激光。激光功率和脉冲数应调整漂白〜30 - 70％在漂白当场中的标记蛋白质。
- 激光触发后，立即开始录制〜200幅图像序列快速漂白后以最快的速率。
- 跟随一个缓慢的漂白后〜50张图片，选择1-20小号的图像之间的延迟，这取决于对蛋白质的扩散速率的序列记录。
- 内部集成所有帧中的漂白剂点的强度和正确的漂白和光强度的波动，收购期间内漂白现货除以参考现货以外的激光漂白面积的平均强度，强度。
- 规范化纠正的力度，使预漂白的强度等于1，初始漂白强度等于0。
- 适合的归一化强度与时间，F（T）曲线，使用下列公式5：
F（T）= M X EXP（- 2T / T）×（我0（2T / T）+ 1（2T / T）），（Eq.1）
其中M是扩散分子的移动部分，T为特征的扩散时间 ，t是每个记录帧的实时，0 和 1 0 日和1日为了修正贝塞尔函数。 - 计算的扩散系数，D为：
D = R 2 / 4T（Eq.2）
其中，R为半径的漂白现货。 - 移动吨Ø未来以及重复步骤2.5） - 2.13）。
- 比较移动的分数和不同的筛选条件获得的扩散系数。屏幕的基础上，促进蛋白质的扩散和不包括未观察到的蛋白扩散条件的组件设计新的结晶。如果蛋白质没有在任何筛选条件弥漫，考虑扩大筛选空间，或试图建构一个新的蛋白质。
3。设置LCP的结晶试验
- 重组蛋白在LCP中所述第1条）。
- 转移到10μL气密注射器连接到一个重复的注射器饮水机蛋白质载货的LCP。
- 将一个可拆卸的短针（表26，10毫米长）10μL注射器。
- 免除表面上形成一个2x2的正方形的四个相邻井200 NL LCP的推注。
- 覆盖每个LCP的推注1μL相应的结晶屏解决方案。
- 第一个18平方毫米的玻璃盖玻片加载井。应用盖玻片温和的压力，密封井。
- 与下一组的4口井重复步骤3.4）-3.6），直到充满整个板块。
- 孵育板在一个恒定的温度，定期检查晶体的形成和生长。
4。收获来自LCP的晶体
- 将一盘线性旋转偏光器和分析仪的配备，可变变焦体视显微镜下的蛋白质晶体。
- 重点以及使用一个低功率放大，使整个以及视野内放置的利益。
- 分数在四个方内部使用的陶瓷毛细管切割石材的尖角以及边界招的玻璃盖玻片。
- 具有很强的尖锐点镊子取得周边各地新闻传播盖玻片玻璃的厚度划痕。
- 冲床的得分广场的对面角落的两个小孔。
- 通过一个孔注入数微升沉淀的解决方案，在随后的步骤，以减少脱水。
- 使用角度尖锐的针探头打破玻璃沿着一个或双方自由切出的平方。
- 小心地抬起立方相丸玻璃广场观看。如果丸是坚持以盖玻片，然后翻转井底超过玻璃广场和地点。
- 沉淀的解决方案中添加额外的几微升，辅以一个冷冻保护剂，如果必要的话，暴露在良好的立方相丸上。
- 增加显微镜的放大倍率，并专注于一个晶体。
- 调整角度之间的偏光器和分析仪增加双折射晶体和背景之间的对比度，同时保持足够的光线，看到收获的循环。
- 选择匹配晶体的大小与一个直径MiTeGen MicroMount，然后收获从LCP的晶体直接舀MicroMount。
- 闪存冻结在液态氮的收获水晶MicroMount，并运到同步辐射光源光束线为X射线数据收集 6 。
5。代表性的成果：
一个精心设计的人β2肾上腺素G蛋白偶联受体（β2 AR - T4L）表示在杆状病毒感染Sf9细胞和dodecylmaltoside（DDM）/胆固醇琥珀酸单酯（CHS）的洗衣粉溶液局部反相激动剂carazolol 7纯化。用Cy3 NHS酯蛋白标记和使用LCP - FRAP预结晶实验（图2）。粗格栅基于LCP - FRAP分析结果选定的几个条件的屏幕产生了最初的水晶般的点击（图3）。沉淀条件的进一步优化产生衍射的晶体（图4）。
图1一个典型的LCP结晶实验流程图。在灰色的方块中的步骤不是在当前的协议。
图2。LCP - FRAP测定β2 monoolein基于LCP的AR-T4L/carazolol。一）一个LCP - FRAP实验结果进行自动高通量模式，在每个样品的96孔板漂白和荧光恢复后30分钟潜伏期测量。所获得的荧光回收率，代表每个样本中的移动部分，绘制所有96个样品。筛选解决方案中包含的0.1 M Tris pH值8，30％V / V聚乙二醇400结合两个不同浓度的48个不同的盐。二）数代表的荧光恢复配置文件resentative条件。实线曲线代表由方程的拟合。 1，移动分数和扩散系数的确定使用式。 1和2。不到10％的样品含有钠氯的快速恢复是由于荧光标记的脂质与蛋白质共同纯化。
图3β2 AR-T4L/carazolol初步晶体点击获得一个粗网格筛选围绕确定的最有前途的条件的LCP - FRAP，含有钠硫酸盐（A组）和Na甲酸（B组）。用Cy3 NHS酯蛋白标记和荧光图像是使用激发波长543纳米和605纳米的排放。
图4β2 AR-T4L/carazolol优化晶体。晶体的图像成长中存在的钠硫酸盐（小组A和B）和K甲酸（板C和D）在明模式（面板A和C），并采用交叉偏光片（板B和D）。
Discussion
该协议提供了一个基本的视觉指导，参与表演观的结晶实验的主要步骤。深度有关这些协议的细节，强调可能存在的缺陷，缺陷或替代路线可在别处 1,2 。可选LCP - FRAP分析可以帮助在早期阶段，选择最有前途的蛋白质构造，LCP主机脂质和脂质添加剂，以及限制可能的沉淀和缓冲条件 3范围。一旦发现一个初步的结晶命中，应该优化，以获得更好的质量的晶体。 观结晶条件的优化是增加 1 LCP的组成相关的额外的参数优化与可溶性蛋白的条件基本类似。膜蛋白油脂中间相生长的晶体，通常是规模较小比洗衣粉溶液中获得的晶体，但更有序，因此，强烈受益从使用微聚焦光束线在现代同步加速器源6。
观的结晶，包括设立结晶或检测板，进行LCP - FRAP分析和检测晶体， 相关的程序，有许多已半自动或全自动化1,2,8,9，允许大范围的条件筛选而消耗少量的蛋白质和脂质。另一方面，在LCP和蛋白质晶体收获reconstitutions保持手册和操作比较繁琐，因此，有需要改进的地方。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是在部分资助，由美国国立卫生研究院拨款GM073197和RR025336。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
