Summary
De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .
Abstract
Membraaneiwitten uitvoeren kritische functies in levende cellen met betrekking tot transductie, vervoer en energie transformaties, en als zodanig betrokken zijn in een veelheid van storingen en ziekten signaal. Er is echter een structurele en functionele kennis van membraaneiwitten sterk achter bij die van hun oplosbare partners, vooral, te wijten aan problemen in verband met hun oplosbaar en het genereren van diffractie kwaliteit kristallen. Kristallisatie in lipidische mesofasen (ook bekend als in meso-of LCP kristallisatie) is een veelbelovende techniek die met succes werd toegepast op een hoge resolutie structuren van microbiële rhodopsins, fotosynthese-eiwitten, buitenste membraan beta vaten en G-eiwit gekoppelde receptoren te verkrijgen. In meso kristallisatie maakt gebruik van een native-achtige membraan omgeving en meestal produceert kristallen met een lager gehalte aan oplosmiddelen en een betere bestellen in vergelijking met traditionele kristallisatie uit detergent oplossingen. De methode is niet moeilijk, maar vereist een begrip van de lipide-fasegedrag en de praktijk in het omgaan met viskeuze mesofase materialen. Hier laten we zien een eenvoudige en efficiënte manier van het maken van LCP en de reconstructie van een membraan eiwit in de lipide dubbellaag van het LCP met behulp van een injectiespuit mixer, gevolgd door doseren nanoliter gedeelten van LCP in een assay of kristallisatie plaat, het uitvoeren van pre-kristallisatie assays en het oogsten van de kristallen de LCP matrix. Deze protocollen bieden een basis handleiding voor het naderen in meso kristallisatie onderzoeken, maar net als bij elke kristallisatie experiment, uitgebreide screening en optimalisatie nodig zijn, en een succesvolle uitkomst is niet per definitie gegarandeerd.
Protocol
Een typische schets van een in meso kristallisatie experiment is te zien in Fig.1 1,2. Pre-kristallisatie LCP-FRAP assays zijn optioneel, maar zij aanzienlijk kunnen versnellen het proces van het zoeken voor een eerste kristallisatie omstandigheden, vooral in het geval van moeilijke membraaneiwitten 3.
1. Eiwit reconstitutie in LCP
- Zuiver een membraan eiwit van interesse in een reinigingsmiddel en concentreren de eiwit / reinigingsmiddel complexen tot ~ 10 - 20 mg / ml, zorg ervoor dat u over-concentratie het wasmiddel 1,4.
- Transfer ~ 25 mg van een LCP gastheer lipiden (meestal monoolein) of een lipide mengsel in een 1,5 ml plastic buisje en incubeer bij 40 ° C gedurende enkele minuten totdat de lipide smelt.
- Bevestig een injectiespuit koppeling naar een 100 ul gasdichte injectiespuit.
- Plaats de spuit met de gesmolten lipide met een regelbaar volume pipet. Noteer het volume van de lipiden in de spuit.
- Plaats een ander 100 pi spuit met het eiwit-oplossing in een eiwitoplossing-to-lipide-verhouding 2 / 3 v / v.
- Met elkaar te verbinden beide spuiten door de spuit koppeling.
- Duw de spuit plunjers afwisselend naar de lipide en eiwit bewegen door de binnenste naald van de koppeling, heen en weer, totdat de lipide mesofase wordt homogeen. LCP vormen spontaan op mechanisch mengen, en het eiwit wordt opgelost in de lipide dubbellaag van LCP. Vorming van LCP kan worden gecontroleerd door de transparante en gel-achtige consistentie en door de afwezigheid van birefringency wanneer bekeken onder een microscoop uitgerust met cross-polarisatoren, of, indien mogelijk, door gebruik te kleine hoek X-stralen diffractie 1.
2. LCP-FRAP Pre-kristallisatie Assays
LCP-FRAP assays zijn ontworpen om de diffusie-eigenschappen van membraaneiwitten opgelost in LCP op een verscheidenheid van screening voorwaarden 3 te meten. De lange-afstands diffusie van membraaneiwitten in LCP is essentieel voor een succesvolle kristallisatie, maar de microstructuur van LCP beperkingen verspreiding van grote eiwitten of oligomere eiwit aggregaten. Een veel voorkomende reden voor het falen van een in meso kristallisatie experiment is een snelle aggregatie van eiwitten leidt tot een verlies van diffusie. Het is aangetoond dat de samenvoeging gedrag van een eiwit is afhankelijk van het specifieke eiwit construct, de gastheer lipiden en de samenstelling van de screening oplossing 3.
- Etiket het eiwit met een fluorescerende kleurstof (Cy3 of gelijkwaardig) op een eiwit / kleurstof verhouding van ~ 100 / 1, verwijder de kleurstof niet gereageerd en concentreer het eiwit tot ~ 1 mg / ml. Label ofwel vrij aminen of gratis thiolen. Bij de etikettering gratis amines, gebruik pH tussen 7 en 7,5 tot voornamelijk het label van de vrije N-terminus. Wees u ervan bewust dat de amino-etikettering ook lipiden co-gezuiverd met het eiwit 2,3 label.
- Reconstitueer de gelabelde eiwit in LCP zoals beschreven in paragraaf 1).
- Stel assay platen, zoals beschreven in hoofdstuk 3) met behulp van LCP-FRAP screening oplossingen in plaats van kristallisatie schermen 2.
- Incubeer de platen bij 20 ° C in het donker voor ten minste 12 uur aan een evenwichtstoestand te bereiken.
- Plaats een van de platen op de LCP-FRAP station en richten zich op de eerste put met behulp van een 10x doelstelling.
- Acquire 5 fluorescerende beelden naar de eerste pre-gebleekt toestand vast te leggen.
- Trigger de laser. Het laservermogen en het aantal pulsen moet worden aangepast voor het bleken van ~ 30 - 70% van de gelabelde eiwitten in het midden van de gebleekte plek.
- Onmiddellijk na het activeren van de laser, start het opnemen van een snelle post-bleken opeenvolging van ~ 200 beelden op de snelst mogelijke tarief.
- Volgen met het opnemen van een langzame post-bleekmiddelen opeenvolging van ~ 50 beelden, het selecteren van de vertraging tussen de beelden als 10-20 s, afhankelijk van de diffusiesnelheid van het eiwit.
- Integreer de intensiteit in het bleekmiddel plek in alle frames en corrigeren voor het bleken en de lichtsterkte fluctuaties bij de overname van delen van de intensiteit in de gebleekte ter plaatse door de gemiddelde intensiteit van een referentiestip buiten de laser gebleekte gebied.
- Normaliseren van de gecorrigeerde intensiteit naar de pre-gebleekt intensiteit die gelijk is aan 1 en de eerste gebleekt intensiteit gelijk aan 0 te maken.
- Passen bij de curve van de genormaliseerde intensiteit versus tijd, F (t), met behulp van de volgende vergelijking 5:
F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1)
waarbij M is de mobiele fractie van diffusie moleculen, T is de karakteristieke diffusie tijd, t is de echte tijd van elke geregistreerde frame, I 0 en I 1 zijn de 0 e en 1 e orde gewijzigde Bessel-functies. - Bereken de diffusie coëfficiënt, D, als:
D = R 2 / 4T, (Eq.2)
waarin R de straal van de gebleekte plek. - Verplaats to het volgende goed en herhaal de stappen 2.5) - 2,13).
- Vergelijk de mobiele fracties en diffusie coëfficiënten verkregen voor de verschillende screening voorwaarden. Ontwerp nieuwe kristallisatie-schermen op basis van de componenten die gefaciliteerd eiwit diffusie en exclusief de voorwaarden voor welk eiwit diffusie niet werd waargenomen. Als het eiwit niet diffuus in een van de gescreende voorwaarden, overwegen om de screening ruimte of te proberen een nieuw eiwit te bouwen.
3. Het opzetten van LCP Kristallisatie Trials
- Reconstrueren het eiwit in LCP zoals beschreven in paragraaf 1).
- Breng de eiwit-beladen LCP in een 10 ul gasdichte injectiespuit bevestigd aan een zich herhalend spuit dispenser.
- Bevestig een korte verwisselbare naald (gauge 26, 10 mm lengte) aan de 10 pi spuit.
- Verdeel 200 nL bolussen van LCP op het oppervlak van de vier aangrenzende putten de vorming van een 2x2 vierkant.
- Overlay elk van de LCP bolussen met 1 pl van overeenkomstige kristallisatie scherm oplossing.
- Cap vier vol putten met een 18 mm vierkante glazen dekglaasje aan. Breng een zachte druk op het dekglaasje om de putten afdichting.
- Herhaal stap 3.4) -3.6) met de volgende reeks van vier putten tot de hele plaat is gevuld.
- Incubeer de plaat op een constante temperatuur, regelmatig te controleren op kristal vorming en groei.
4. Oogsten Kristallen van LCP
- Plaats een bord met eiwitkristallen onder een stereomicroscoop met variabele zoom, uitgerust met een roterende lineaire polarisator en analysator.
- Focus op de bron van belang het gebruik van een low power zoom, zodat het geheel goed wordt geplaatst binnen het gezichtsveld.
- Scoren het dekglaasje glas in vier slagen het maken van een vierkant binnen de grenzen goed met behulp van een scherpe hoek van een keramische capillaire snijden steen.
- Druk op rond de omtrek scoorde met sterke scherpe punt pincet om de krassen voortplanten door de dikte van het dekglaasje glas.
- Punch twee kleine gaatjes aan de tegenovergestelde hoeken van het plein gescoord.
- Injecteer enkele pi van neerslagmiddelen oplossing door een van de gaten om uitdroging te verminderen tijdens de daaropvolgende stappen.
- Met behulp van een haakse scherpe naald sonde breken het glas langs een of twee kanten aan de cut-out plein vrij.
- Til het glas plein kijken voor de kubieke fase bolus. Als de bolus is vast aan het dekglaasje, draai het glas plein over en op de bodem van de put.
- Voeg een extra paar pi van neerslagmiddelen oplossing, aangevuld met een cryo-protectant, indien nodig, op de top van de blootgestelde kubieke fase bolus in de put.
- De vergroting van de microscoop en de focus op een kristal.
- Pas de hoek tussen de polarisator en de analysator om het contrast tussen de dubbelbrekend kristal en op de achtergrond te verhogen, met behoud van genoeg licht om de oogst loop te zien.
- Selecteer een MiTeGen MicroMount met een diameter overeenkomt met de kristal grootte en dan direct de oogst van het kristal uit de LCP door scheppen het in de MicroMount.
- Flash bevriezen MicroMount met de geoogste kristal in vloeibare stikstof, en het schip naar een synchrotron bron bundellijn voor X-ray het verzamelen van gegevens 6.
5. Representatieve resultaten:
Een aangelegde menselijke bèta-2-adrenerge G-eiwit gekoppelde receptor (β 2 AR-T4L) werd uitgedrukt in baculovirus geïnfecteerde Sf9 insectencellen en gezuiverd in dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinaat (CHS) detergent oplossing gebonden aan een partiële agonist inverse carazolol 7. Het eiwit werd gelabeld met Cy3 NHS ester en wordt gebruikt in LCP-FRAP pre-kristallisatie assays (figuur 2). Grof grid-schermen op basis van een aantal voorwaarden geselecteerd uit de resultaten van de LCP-FRAP assays produceerde de eerste kristal-achtige hits (figuur 3). Verdere optimalisatie van neerslagmiddelen voorwaarden leverde diffractie kwaliteit kristallen (figuur 4).
Figuur 1. Flow-chart van een typisch LCP kristallisatie experiment. Stappen in de grijze velden zijn niet beschreven in de huidige protocollen.
Figuur 2. LCP-FRAP test met β 2 AR-T4L/carazolol in monoolein op basis van LCP. A) De resultaten van een LCP-FRAP test uitgevoerd in een automatische high-throughput-modus, waarbij elk monster van een 96-wells plaat sequentieel is gebleekt en fluorescentie herstel is gemeten na een 30 minuten incubatie. De verkregen fluorescentie terugvorderingen, die de mobiele fractie in elk monster vertegenwoordigen, worden uitgezet voor alle 96 monsters. De screening oplossingen bevatten 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 in combinatie met 48 verschillende zouten op twee verschillende concentraties. B) Fluorescentie herstel profielen voor verschillende reprepresentatieve omstandigheden. Vaste lijn curves past door Eq. 1.Het mobiele fracties en de diffusie coëfficiënten worden bepaald met behulp van MKN. 1 en 2. Snel herstel van minder dan 10% in het monster met Na-chloride is het gevolg van fluorescent gelabelde lipiden co-gezuiverd met het eiwit.
Figuur 3. Initiële kristal hits van β 2 AR-T4L/carazolol verkregen door een grof raster screening rond de meest veelbelovende voorwaarden die door de LCP-FRAP, met daarin Na sulfaat (paneel A) en Na Formate (paneel B). Het eiwit is gelabeld met Cy3 NHS ester en de fluorescerende beelden worden gemaakt met excitatie bij 543 nm en emissie bij 605 nm.
Figuur 4. Geoptimaliseerd kristallen van β 2 AR-T4L/carazolol. De beelden van kristallen gekweekt in de aanwezigheid van Na sulfaat (panelen A en B) en K Formate (panelen C en D) worden genomen in de helderveld-modus (panelen A en C) en het gebruik van cross-polarisatoren (panelen B en D).
Discussion
De protocollen bieden een basis visuele leidraad voor de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van in meso kristallisatie experimenten. Meer diepgaande details met betrekking tot deze protocollen, met de nadruk mogelijke valkuilen, tekortkomingen of alternatieve routes zijn elders beschikbaar 1,2. Optionele LCP-FRAP testen kunnen helpen bij de eerdere stadia van de meest veelbelovende eiwitten te bouwen, LCP gastheer lipiden en lipide additieven, evenals beperking van de range van mogelijke neerslagmiddelen en buffer voorwaarden 3 te selecteren. Zodra een eerste kristallisatie hit wordt gevonden, moet worden geoptimaliseerd om een betere kwaliteit kristallen te verkrijgen. Optimalisatie van in meso kristallisatie omstandigheden wezen gelijkwaardig is aan het optimaliseren van de voorwaarden voor oplosbare eiwitten met de toevoeging van extra parameters in verband met de samenstelling van een LCP. Membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische mesofase zijn meestal kleiner dan kristallen verkregen in detergent oplossing, maar meer besteld, dus profiteert sterk van het gebruik van microfocus bundellijnen verkrijgbaar bij de moderne synchrotron bronnen 6.
Veel van de procedures met betrekking tot in meso kristallisatie, inclusief het opzetten van kristallisatie of assay platen, het uitvoeren van LCP-FRAP assays en het opsporen van kristallen, zijn semi-of volautomatische 1,2,8,9, waardoor het screenen van een groot aantal voorwaarden terwijl het verbruiken kleine hoeveelheden eiwitten en lipiden. Aan de andere kant, eiwit reconstructies in LCP en kristal oogsten blijven handleiding en meer vervelende operaties en, dus, hebben een behoefte aan verbetering.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd in delen door de NIH beurzen GM073197 en RR025336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
