Summary
Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .
Abstract
Membranproteine erfüllen wichtige Funktionen in lebenden Zellen in Bezug auf Transduktion, Verkehr und Energie Transformationen und als solche sind in einer Vielzahl von Störungen und Erkrankungen beteiligt Signal. Jedoch ist eine strukturelle und funktionelle Verständnis von Membranproteinen stark hinterherhinken, dass ihrer löslichen Partnern, vor allem wegen Schwierigkeiten mit ihrer Solubilisierung und Generation der Beugung Qualität Kristalle verbunden. Kristallisation in Lipid-Mesophasen (auch in meso-oder LCP Kristallisation bekannt) ist eine vielversprechende Technik, die erfolgreich angewendet wurde, um hochauflösende Strukturen mikrobieller Rhodopsine, photosynthetischen Proteinen der äußeren Membran beta Fässer und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu erhalten. In meso Kristallisation nutzt eine native-like-Membran-Umgebung und in der Regel produziert Kristalle mit niedriger Lösemittelgehalt und besseren Ordnung zu herkömmlichen Kristallisation aus Wasch-Lösungen. Die Methode ist nicht schwierig, erfordert aber ein Verständnis der Lipidphase Verhalten und Praxis im Umgang mit viskosen Mesophase Materialien. Hier zeigen wir eine einfache und effiziente Art und Weise zu machen LCP und Wiederherstellung einer Membran-Protein in die Lipid-Doppelschicht der LCP mit einer Spritze Mischer, durch den Verzicht Nanoliter Teile des LCP in einem Test oder Kristallisation Platte, die Durchführung von Vor-Kristallisation Assays und Ernte Kristalle aus, gefolgt die LCP-Matrix. Diese Protokolle stellen ein grundlegender Leitfaden für die Annäherung in meso Kristallisation Studien, aber wie bei jeder Kristallisation Experiment umfangreichen Screening und Optimierung erforderlich sind, und ein erfolgreiches Ergebnis ist nicht unbedingt gewährleistet.
Protocol
Eine typische Gliederung eines in meso Kristallisation Experiment ist in Abb. 1 1,2 dargestellt. Pre-Kristallisation LCP-FRAP-Assays sind optional, aber sie können erheblich beschleunigen den Prozess der Suche nach anfänglichen Kristallisation Bedingungen, insbesondere im Fall der schwer Membran Proteinen 3.
1. Protein Rekonstitution in LCP
- Purify ein Membranprotein von Interesse in einer Reinigungslösung und konzentrieren das Protein / Detergenz-Komplexen zu ~ 10 bis 20 mg / mL, dabei nicht über-Konzentrat das Waschmittel 1,4.
- Transfer ~ 25 mg eines LCP-Host-Lipid (typischerweise Monoolein) oder einer Lipid-Mischung in eine 1,5 ml Plastikröhrchen und Inkubieren bei 40 ° C für wenige Minuten, bis die Lipid-schmilzt.
- Bringen Sie eine Spritze Kupplung zu 100 ul gasdichte Spritze.
- Legen Sie die Spritze mit dem geschmolzenen Lipid mit einem Volumen einstellbare Pipette. Notieren Sie die Lautstärke des Lipids in der Spritze.
- Legen Sie weitere 100 ul Spritze mit dem Protein-Lösung bei einer Protein-Lösung-to-Lipid-Verhältnis 2 / 3 v / v.
- Verbinden Sie beide Spritzen gemeinsam durch die Spritze Koppler.
- Drücken Sie den Spritzenkolben abwechselnd an die Lipid-und Protein durch die innere Nadel des Kopplers bewegen, hin und her, bis die Lipid-Mesophase homogen wird. LCP bildet sich spontan auf ein mechanisches Mischen, und das Protein wird rekonstituiert in die Lipid-Doppelschicht der LCP. Die Bildung von LCP kann durch seine transparente und gelartige Konsistenz und durch das Fehlen der Doppelbrechung überprüft werden, wenn sie unter einem Mikroskop mit cross-Polarisatoren ausgestattet angesehen, oder, wenn möglich, durch kleine Winkel Röntgenbeugung 1.
2. LCP-FRAP Pre-Kristallisation Assays
LCP-FRAP-Assays wurden entwickelt, um die Diffusion Eigenschaften von Membranproteinen rekonstituiert in LCP in einer Vielzahl von Screening-Bedingungen 3 zu messen. Die Langstrecken-Diffusion von Membranproteinen in LCP ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche Kristallisation, allerdings schränkt die Mikrostruktur von LCP Verbreitung von großen Proteinen oder oligomeren Protein-Aggregaten. Eine häufige Ursache für Ausfall eines in meso Kristallisation Experiment ist eine schnelle Protein-Aggregation führt zu einem Verlust der Diffusion. Es hat sich gezeigt, dass das Aggregationsverhalten des Proteins auf das jeweilige Protein zu konstruieren, die Host-Lipid-und die Zusammensetzung der Screening-Lösung 3 abhängt.
- Beschriften Sie die Protein mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cy3 oder ähnlich) an ein Protein / Farbstoff-Verhältnis von ~ 100 / 1, entfernen Sie das nicht umgesetzte Farbstoff und konzentrieren das Protein ~ 1 mg / mL. Label entweder freie Amine oder freie Thiole. Bei der Kennzeichnung freie Amine, verwenden Sie pH-Wert zwischen 7 und 7,5 bis überwiegend Etikett der freien N-Terminus. Seien Sie sich bewusst, dass Aminosäuren Kennzeichnung können auch Label Lipiden mit dem Protein 2,3 co-gereinigt.
- Lösen Sie das markierte Protein in LCP, wie in Abschnitt 1 beschrieben).
- Set up Testplatten, wie in Abschnitt 3 beschrieben) mit LCP-FRAP Screening-Lösungen anstelle von Kristallisation Bildschirme 2.
- Die Inkubation bei 20 ° C im Dunkeln für mindestens 12 Stunden, um einen Gleichgewichtszustand zu erreichen.
- Legen Sie eine der Platten auf dem LCP-FRAP-Station und konzentrieren sich auf die erste Bohrung mit einem 10x-Objektiv.
- Erwerben 5 Leuchtfarben Bilder auf den ersten Pre-gebleichten Zustand zu erfassen.
- Auslöser des Lasers. 70% des markierten Proteins in der Mitte des gebleichten Fleck - Die Laserleistung und Anzahl der Impulse sollten zu bleichen ~ 30 eingestellt werden.
- Unmittelbar nach dem Auslösen des Lasers, starten Sie die Aufnahme einer schnellen post-Bleichsequenz von ~ 200 Bilder mit der schnellstmöglichen Geschwindigkeit.
- Folgen Sie mit der Aufnahme eines langsamen post-bleach Sequenz von ~ 50 Bilder, die Auswahl der Verzögerung zwischen den Bildern als 1-20 s, abhängig von der Diffusionsrate des Proteins.
- Integrieren Sie die Intensität in der Bleich-Spot in allen Frames und korrigieren Sie zum Bleichen und Lichtintensitätsschwankungen bei der Akquisition, indem die Intensität im gebleichten vor Ort durch die gemittelte Intensität einer Referenz vor Ort außerhalb des Lasers gebleichten Bereich.
- Normalisieren der korrigierten Intensität der Vor-gebleichtem Intensität gleich 1 und die anfängliche gebleichtem Intensität gleich 0 zu machen.
- Fit der Kurve der normierten Intensität gegen die Zeit, F (t), mit der folgenden Gleichung 5:
F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1)
wo M das mobile Bruchteil der diffundierenden Moleküle ist, T die charakteristische Diffusionszeit ist, t die Echtzeit von jedem aufgenommenen Bild, I 0 und I 1 sind die 0-te und 1. Ordnung modifizierten Bessel-Funktionen. - Berechnen Sie die Diffusionskoeffizienten, D, wie:
D = R 2 / 4T, (Gleichung 2)
wobei R der Radius des gebleichten Stelle. - Bewegen to den nächsten gut und wiederholen Sie die Schritte 2,5) - 2,13).
- Vergleichen Sie die mobilen Fraktionen und Diffusionskoeffizienten für die verschiedenen Screening-Bedingungen erhalten. Design neuer Kristallisationspunkt Bildschirme auf Basis der Komponenten, Protein Diffusion und ohne Bedingungen, für die Protein-Diffusion nicht beobachtet wurde erleichtert. Wenn das Protein nicht diffuse in einem der abgeschirmten Bedingungen Erwägung einer Ausweitung des Screening-Raum oder versuchen ein neues Protein zu konstruieren.
3. Einrichten LCP Kristallisation Trials
- Lösen Sie das Protein in LCP, wie in Abschnitt 1 beschrieben).
- Übertragen Sie die Protein-beladenen LCP in ein 10 l gasdichte Spritze an einem sich wiederholenden Spritzenspender.
- Bringen Sie eine kurze austauschbare Nadel (Spurweite 26, 10 mm Länge), um die 10 l Spritze.
- Geben Sie 200 nL Boli von LCP auf der Oberfläche von vier benachbarten Vertiefungen bilden ein 2x2-Quadrat.
- Overlay jeder der LCP Boli mit 1 ul der entsprechenden Kristallisation Bildschirm-Lösung.
- Cap vier beladene Brunnen mit einem 18 mm im Quadrat Deckglas. Tragen Sie einen sanften Druck auf das Deckglas in die Vertiefungen zu versiegeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.4) -3,6) mit dem nächsten Satz von 4 Brunnen, bis die ganze Platte gefüllt ist.
- Die Platte mit einer konstanten Temperatur, regelmäßige Überprüfung zur Kristallbildung und Wachstum.
4. Harvesting Kristalle aus LCP
- Legen Sie eine Platte mit Proteinkristallen unter einem Stereomikroskop mit variablem Zoom, mit einem linearen rotierenden Polarisator und Analysator ausgestattet.
- Konzentrieren Sie sich auf das Wohl von Interesse mit einem Low-Power-Zoom, so dass das ganze auch im Blickfeld platziert.
- Ergebnis der Deckglas Glas in vier Schläge, einen Platz innerhalb der Grenzen und mit einem scharfen Ecke eines Keramikkapillare Schneiden von Stein.
- Drücken Sie rund um die erzielte Umfang mit starken scharfen Punkt einer Pinzette die Kratzer, die durch die Dicke des Deckglases Glas ausbreiten.
- Punch zwei kleine Löcher an gegenüberliegenden Ecken des Platzes erzielt.
- Inject wenigen ul Fällungslösung durch eines der Löcher, um eine Dehydratation während der nachfolgenden Schritte zu reduzieren.
- Mit einer abgewinkelten spitzen Nadel Fühlerbruch das Glas entlang einer oder zwei Seiten, die cut-out Platz frei.
- Heben Sie das Glas Platz gerade für die kubische Phase Bolus. Wenn der Bolus den Deckglas geklebt wird, dann drehen Sie das Glas Platz über und auf dem Grund des Brunnens.
- Fügen Sie ein zusätzliches paar ul Fällungslösung, ergänzt mit einem Kryo-Schutzmittel, falls erforderlich, auf der exponierten kubischen Phase Bolus in den Brunnen.
- Erhöhung des Mikroskops und konzentrieren sich auf einen Kristall.
- Passen Sie den Winkel zwischen dem Polarisator und den Analysator, um den Kontrast zwischen dem doppelbrechenden Kristall und dem Hintergrund zu erhöhen, und dabei genug Licht, um die Ernte Schleife zu sehen.
- Wählen Sie einen MiTeGen MicroMount mit einem Durchmesser passenden Größe des Kristalls und dann ernten den Kristall direkt aus dem LCP mit einer Schöpfkelle in die MicroMount.
- Flash-Freeze der MicroMount mit den geernteten Kristalle in flüssigem Stickstoff, und verschicken Sie es zu einem Synchrotron Source Beamline für X-ray-Daten Sammlung 6.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Eine manipulierte menschliche beta 2-adrenerge G-Protein-gekoppelten Rezeptor (β 2 AR-T4L) wurde in Baculovirus infizierten Sf9-Insektenzellen und gereinigt in Dodecylmaltosid (DDM) / Cholesteryl hemisuccinat (CHS) Reinigungslösung gebunden an eine partielle inverse Agonisten Carazolol 7 ausgedrückt. Das Protein wurde mit Cy3-NHS-Ester markiert und in LCP-FRAP Vorkristallisation Assays (Abbildung 2). Grobes Raster-Bildschirme von mehreren Bedingungen aus den Ergebnissen der LCP-FRAP-Assays ausgewählt wurden produziert erste Kristall-like hits (Abbildung 3). Weitere Optimierung der Fällungsmittel Bedingungen ergab Beugung Qualität Kristalle (Abbildung 4).
Abbildung 1. Flow-Diagramm eines typischen LCP Kristallisation Experiment. Schritte in den grauen Kästen sind nicht in der aktuellen Protokollen beschrieben.
Abbildung 2. LCP-FRAP-Assay mit β 2 AR-T4L/carazolol in Monoolein Basis LCP. A) Ergebnisse einer LCP-FRAP-Assay in einer automatischen Hochdurchsatz-Modus durchgeführt, in denen jede Probe einer 96-Well-Platte sequentiell und gebleicht Fluoreszenz Erholung ist nach einer 30 min Inkubation gemessen. Die erhaltenen Fluoreszenz Erholungen, die den mobilen Teil in jeder Probe stellen, sind für alle 96 Proben aufgetragen. Die Screening-Lösungen enthalten 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 mit 48 verschiedene Salze in zwei verschiedenen Konzentrationen kombiniert. B) Fluorescence Recovery-Profile für mehrere reptreter Bedingungen. Die durchgezogene Linie Kurven stellen passt durch Gl. 1.Die mobilen Fraktionen und die Diffusionskoeffizienten werden anhand Gl. 1 und 2. Schnelle Wiederherstellung von weniger als 10% in der Probe mit Na-Chlorid ist darauf zurückzuführen, fluoreszenzmarkierten Lipiden mit dem Protein co-gereinigt.
Abbildung 3. Initial Kristall Hits von β 2 AR-T4L/carazolol durch ein grobes Raster-Screening rund vielversprechendsten Bedingungen durch LCP-FRAP identifiziert erhalten, mit Na-Sulfat (Panel A) und Na Formate (Panel B). Das Protein wird mit Cy3-NHS-Ester markiert und die Fluoreszenz-Bilder sind aufgenommen mit einer Anregung bei 543 nm und Emission bei 605 nm.
Abbildung 4. Optimized Kristalle von β 2 AR-T4L/carazolol. Die Bilder der Kristalle in Gegenwart von Na-Sulfat gewachsen (Abb. A und B) und K Formate (Panels C und D) sind in der Hellfeld-Modus (Abb. A und C) entnommen und mittels Cross-Polarisatoren (Platten B und D).
Discussion
Die Protokolle bieten eine grundlegende visuelle Orientierung für die wichtigsten Schritte bei der Durchführung in meso Kristallisation Experimenten beteiligt. Weitere ausführliche Informationen im Zusammenhang mit diesen Protokollen, betont mögliche Fallstricke sind Mängel oder alternative Routen an anderer Stelle 1,2. Optional LCP-FRAP-Untersuchungen können in früheren Phasen helfen, die vielversprechendsten Protein zu konstruieren, LCP Host Lipid-und Lipid-Additive sowie das Spektrum der möglichen Fällungs-und Pufferbedingungen 3 zu wählen. Nach einer ersten Kristallisation Hit gefunden wird, sollte sie optimiert, um bessere Qualität Kristalle zu erhalten. Optimierung in meso Kristallisationsbedingungen ist im Wesentlichen ähnlich Optimierung der Bedingungen für lösliche Proteine mit der Zugabe von zusätzlichen Parametern mit der Zusammensetzung des LCP 1 zugeordnet. Membrane Protein-Kristalle in Lipid-Mesophase gewachsen sind typischerweise kleiner als Kristalle in Wasch-Lösung erhalten, aber mehr bestellt, so profitiert stark von der Nutzung Mikrofokus Strahlrohre am modernen Synchrotron-Quellen 6 zur Verfügung.
Viele der Verfahren im Zusammenhang mit in meso Kristallisation, einschließlich der Einrichtung Kristallisation oder Testplatten, die Durchführung von LCP-FRAP-Assays und Detektion Kristalle, wurden halb-oder vollautomatische 1,2,8,9, so dass Screening einer großen Reihe von Bedingungen und verbrauchen dabei kleine Mengen von Protein-und Lipid. Auf der anderen Seite bleiben Protein Rekonstruktionen in LCP und Kristall Ernte manuelle und langwierige Operationen und damit eine Notwendigkeit für Verbesserungen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde in Teilen durch die NIH gewährt GM073197 und RR025336 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
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