Summary
प्रोटोकॉल विवर्तन एक झिल्ली एक lipídic घन चरण (LCP) में प्रोटीन का पुनर्गठन से शुरू प्रोटीन की गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है, LCP - FRAP पूर्व crystallization assays के साथ प्रारंभिक स्थितियों खोजने LCP crystallization परीक्षण और क्रिस्टल कटाई की स्थापना .
Abstract
झिल्ली प्रोटीन रहने वाले पारगमन परिवहन और ऊर्जा परिवर्तनों, और, जैसे, malfunctions और रोगों के एक भीड़ में फंसा रहे हैं संकेत करने के लिए संबंधित कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कार्य है. हालांकि, कि उनके घुलनशील भागीदारों के पीछे झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक समझ जोरदार ठंड है, मुख्य रूप से उनके और विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल के solubilization पीढ़ी के साथ जुड़े कठिनाइयों के कारण,. Lipídic mesophases में Crystallization (meso या LCP crystallization के रूप में भी जाना जाता है) एक आशाजनक तकनीक है जो सफलतापूर्वक माइक्रोबियल rhodopsins, संश्लेषक प्रोटीन, बाहरी झिल्ली बीटा बैरल और जी प्रोटीन रिसेप्टर्स मिलकर की उच्च संकल्प संरचनाओं प्राप्त लागू किया गया है . Meso में crystallization एक झिल्ली देशी जैसे वातावरण का लाभ लेता है और आम तौर पर कम विलायक सामग्री और बेहतर आदेश के रूप में डिटर्जेंट के समाधान से पारंपरिक crystallization की तुलना के साथ क्रिस्टल का उत्पादन. विधि मुश्किल नहीं है, लेकिन लिपिड चरण और चिपचिपा mesophase सामग्री से निपटने में व्यवहार अभ्यास के एक समझने की आवश्यकता है है. यहाँ हम LCP बनाने और LCP के लिपिड bilayer एक सिरिंज मिक्सर, एक परख या crystallization थाली में LCP के nanoliter भाग वितरण, पूर्व crystallization assays के आयोजन से क्रिस्टल कटाई द्वारा पीछा का उपयोग में एक झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करने का एक सरल और कारगर तरीका का प्रदर्शन LCP मैट्रिक्स. ये प्रोटोकॉल meso crystallization परीक्षण में आ करने के लिए एक बुनियादी मार्गदर्शन प्रदान, लेकिन, किसी भी crystallization प्रयोग, व्यापक प्रदर्शन और अनुकूलन के साथ रूप में आवश्यक हैं, और एक सफल परिणाम के लिए जरूरी गारंटी नहीं है.
Protocol
Meso crystallization प्रयोग में एक की विशिष्ट रूपरेखा 1,2 Fig.1 में दिखाया गया है. पूर्व crystallization LCP FRAP assays के वैकल्पिक हैं, लेकिन वे काफी मुश्किल झिल्ली प्रोटीन 3 के मामले में विशेष रूप से प्रारंभिक crystallization स्थितियों के लिए खोज की प्रक्रिया कर सकते हैं तेजी लाने ,.
1. LCP में प्रोटीन पुनर्गठन
- एक डिटर्जेंट समाधान में ब्याज की एक झिल्ली प्रोटीन शुद्ध और ~ 10 प्रोटीन / डिटर्जेंट परिसरों ध्यान - 20 मिलीग्राम / एमएल-over ध्यान केंद्रित डिटर्जेंट 1,4 करने के लिए देखभाल नहीं ले रही.
- ~ स्थानांतरण एक LCP मेजबान (आमतौर पर monoolein) लिपिड या 1.5 एमएल प्लास्टिक और 40 में ट्यूब सेते में एक लिपिड मिश्रण के 25 मिलीग्राम ° सी कुछ मिनट के लिए जब तक लिपिड पिघला देता है.
- एक 100 μL सिरिंज गैस तंग करने के लिए एक सिरिंज युग्मक संलग्न.
- पिघला हुआ लिपिड का उपयोग कर एक समायोज्य मात्रा विंदुक के साथ सिरिंज लोड. सिरिंज में लिपिड की मात्रा रिकॉर्ड.
- प्रोटीन समाधान के साथ एक प्रोटीन समाधान के लिए लिपिड अनुपात 2 / 3 v / एक और 100 μL सिरिंज लोड वी.
- सिरिंज युग्मक के माध्यम से दोनों सीरिंज के साथ कनेक्ट.
- पुश सिरिंज एकांतर plungers युग्मक के भीतर सुई के माध्यम से लिपिड और प्रोटीन कदम, आगे और पीछे, जब तक लिपिड mesophase सजातीय हो जाता है. LCP यांत्रिक मिश्रण पर अनायास रूपों, और प्रोटीन LCP के लिपिड bilayer में पुनर्गठित हो जाता है. LCP का गठन इसके पारदर्शी और जेल की तरह स्थिरता और birefringency के अभाव के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है जब पार polarizers के साथ एक सुसज्जित खुर्दबीन के नीचे देखा, या यदि संभव हो, छोटे कोण एक्स - रे 1 विवर्तन का उपयोग करके.
2. LCP FRAP पूर्व crystallization Assays
LCP - FRAP assays झिल्ली प्रोटीन के प्रसार गुण स्क्रीनिंग 3 शर्तों के एक किस्म में LCP में पुनर्गठन को मापने के लिए डिजाइन किए हैं. LCP में झिल्ली प्रोटीन के लंबी दूरी के प्रसार सफल crystallization के लिए आवश्यक है, तथापि, LCP के microstructure बड़े प्रोटीन या oligomeric प्रोटीन समुच्चय के प्रसार constrains. Meso crystallization प्रयोग में एक की विफलता के लिए एक आम कारण एक तेजी से प्रोटीन एकत्रीकरण प्रसार का एक नुकसान के लिए अग्रणी है. यह दिखाया गया है कि एक प्रोटीन की एकत्रीकरण व्यवहार विशेष प्रोटीन का निर्माण, मेजबान लिपिड और स्क्रीनिंग 3 समाधान की संरचना पर निर्भर करता है.
- 100 / 1 ~ एक प्रोटीन / डाई अनुपात में एक फ्लोरोसेंट रंजक (Cy3 या समान) के साथ प्रोटीन लेबल, unreacted डाई हटाने और ~ मिलीग्राम / एमएल एक प्रोटीन ध्यान. लेबल या तो मुक्त amines या मुफ्त thiols. जब मुफ्त amines लेबलिंग, 7 और 7.5 के बीच पीएच का उपयोग करने के लिए predominately मुक्त एन टर्मिनस लेबल. पता है कि अमीनो लेबलिंग भी 2,3 प्रोटीन के साथ सह - शुद्ध लिपिड लेबल कर सकते हैं.
- LCP में लेबल प्रोटीन के रूप में 1 अनुभाग में वर्णित reconstitute).
- परख प्लेटें सेट के रूप में धारा 3 में वर्णित) crystallization 2 स्क्रीन के बजाय LCP FRAP स्क्रीनिंग समाधान का उपयोग.
- पर 20 प्लेटें सेते ° करने के लिए एक संतुलन राज्य प्राप्त करने के लिए कम से कम 12 घंटे के लिए अंधेरे में सी.
- LCP FRAP और स्टेशन पर अच्छी तरह से पहले एक 10x उद्देश्य का उपयोग पर ध्यान केंद्रित एक प्लेटों के रखें.
- 5 फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक पूर्व प्रक्षालित राज्य पर कब्जा करने के लिए.
- लेजर ट्रिगर. प्रक्षालित स्थान के बीच में लेबल प्रोटीन का 70% - लेजर और दालों की शक्ति संख्या 30 ~ ब्लीच करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
- लेजर ट्रिगर के तुरंत बाद, सबसे तेजी से संभव दर पर ~ 200 छवियों की एक तेजी से अनुक्रम बाद विरंजन रिकॉर्डिंग शुरू.
- बाद ब्लीच अनुक्रम ~ 50 छवियों, 1-20 के रूप में छवियों के बीच में देरी का चयन, प्रोटीन की प्रसार दर पर निर्भर करता है की एक धीमी गति से की रिकॉर्डिंग के साथ पालन करें.
- सभी फ्रेम में ब्लीच स्थान के अंदर तीव्रता एकीकृत और यह विरंजन और प्रक्षालित हाजिर अंदर लेजर प्रक्षालित क्षेत्र के बाहर एक संदर्भ हाजिर औसतन तीव्रता तीव्रता को विभाजित करके प्रकाश तीव्रता उतार चढ़ाव अधिग्रहण के दौरान करने के लिए सही है.
- सही तीव्रता सामान्यकरें पूर्व प्रक्षालित 1 के बराबर तीव्रता और प्रारंभिक प्रक्षालित 0 के बराबर तीव्रता.
- सामान्यीकृत तीव्रता बनाम समय, एफ (टी) की वक्र फ़िट निम्नलिखित 5 समीकरण का उपयोग कर:
एफ (टी) = एम x (2T / टी) ऍक्स्प (x मैं (/ 2T टी) 0 + 1 मैं (/ 2T टी)), (Eq.1)
जहां एम diffusing के अणुओं की मोबाइल अंश है, टी विशेषता प्रसार समय है, दर्ज की प्रत्येक फ्रेम के वास्तविक समय है, मैं 0 और मैं 1 0 वीं और 1 सेंट संशोधित आदेश Bessel कार्य कर रहे हैं. - प्रसार गुणांक, विकास, की गणना के रूप में:
डी आर = / 2 4T, (Eq.2)
जहां आर प्रक्षालित मौके की त्रिज्या है. - टी हटो2.13) - अगले अच्छी तरह से और दोहराने कदम 2.5) ओ.
- मोबाइल भिन्न और प्रसार गुणांक विभिन्न स्क्रीनिंग की स्थिति के लिए प्राप्त की तुलना करें. डिजाइन नए crystallization घटक है कि प्रोटीन प्रसार और शर्तों जिसके लिए प्रोटीन प्रसार नहीं मनाया गया छोड़कर सुविधा पर आधारित स्क्रीन. यदि प्रोटीन जांच की शर्तों में से किसी में फैलाना नहीं था, स्क्रीनिंग अंतरिक्ष का विस्तार करने की कोशिश कर रहा है या एक नए प्रोटीन का निर्माण करने पर विचार करें.
3. LCP Crystallization परीक्षण की स्थापना
- LCP reconstitute में प्रोटीन के रूप में 1 अनुभाग में वर्णित).
- प्रोटीन से लदी एक 10 μL गैस तंग एक दोहराव सिरिंज मशीन से जुड़ी सिरिंज में LCP स्थानांतरण.
- 10 μL सिरिंज के लिए एक छोटी हटाने योग्य सुई (26 गेज, 10 मिमी लंबाई) संलग्न.
- चार सटे एक 2x2 वर्ग बनाने कुओं की सतह पर 200 LCP के NL boluses बग़ैर.
- इसी crystallization स्क्रीन समाधान के 1 μL के साथ प्रत्येक LCP boluses ओवरले.
- कैप एक 18 मिमी वर्ग कांच coverslip साथ चार भरी हुई कुओं. Coverslip पर एक सौम्य दबाव के कुओं मुहर लगाओ.
- दोहराएँ कदम 3.4) -3.6) 4 कुओं के अगले सेट के साथ जब तक पूरी थाली भर है.
- एक लगातार तापमान पर थाली सेते हैं, क्रिस्टल के गठन और विकास के लिए समय - समय पर जाँच.
4. LCP से फसल काटने वाले कण
- चर ज़ूम के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत प्रोटीन क्रिस्टल, एक रैखिक घूर्णन polarizer और विश्लेषक के साथ सुसज्जित के साथ एक थाली प्लेस.
- हित के अच्छी तरह से एक कम शक्ति ज़ूम है ताकि पूरी अच्छी तरह से देखने के क्षेत्र के भीतर रखा जाता है का उपयोग पर ध्यान दें.
- कुल चार अच्छी तरह से एक चीनी मिट्टी केशिका काटने के पत्थर के एक तेज कोने का उपयोग सीमाओं के अंदर एक वर्ग बनाने स्ट्रोक में coverslip कांच.
- परिधि के चारों ओर मजबूत तेज बिंदु चिमटी के साथ बने प्रेस coverslip कांच की मोटाई के माध्यम से खरोंच प्रचार.
- पंच रन बनाए वर्ग के विपरीत कोनों पर दो छोटे छेद.
- बाद के चरणों के दौरान निर्जलीकरण कम एक छेद के माध्यम से तेज़ समाधान के कुछ μL इंजेक्षन.
- एक angled तेज सुई जांच का प्रयोग एक या दो पक्षों के साथ कांच तोड़ने के लिए वर्ग कट आउट मुक्त.
- ध्यान घन चरण सांस के लिए गिलास वर्ग देख लिफ्ट. यदि सांस coverslip करने के लिए अटक गया है, तो अच्छी तरह से नीचे पर कांच और जगह से अधिक वर्ग फ्लिप.
- तेज़ समाधान के एक अतिरिक्त कुछ μL, के साथ पूरक जोड़ें एक क्रायो protectant, यदि आवश्यक हो, में अच्छी तरह से उजागर घन चरण सांस के शीर्ष पर.
- माइक्रोस्कोप के आवर्धन बढ़ाने के लिए और एक क्रिस्टल पर ध्यान केंद्रित.
- Polarizer और विश्लेषक birefringent क्रिस्टल और पृष्ठभूमि के बीच इसके विपरीत में वृद्धि के बीच कोण समायोजित, जबकि करने के लिए पर्याप्त कटाई पाश देख प्रकाश रखने.
- एक क्रिस्टल आकार मिलान व्यास के साथ एक MiTeGen MicroMount का चयन करें और तब क्रिस्टल सीधे MicroMount में scooping द्वारा LCP से फसल.
- फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में काटा क्रिस्टल के साथ MicroMount फ्रीज, और उसे एक्स - रे डेटा संग्रह के लिए 6 सिंक्रोटॉन स्रोत beamline के लिए जहाज .
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एक इंजीनियर मानव बीटा 2 एड्रीनर्जिक जी रिसेप्टर प्रोटीन युग्मित (2 AR-T4L β) sf9 कीट कोशिकाओं को संक्रमित और (DDM) dodecylmaltoside / cholesteryl hemisuccinate (CHS) डिटर्जेंट समाधान एक आंशिक व्युत्क्रम 7 carazolol agonist के लिए बाध्य में शुद्ध baculovirus में व्यक्त किया गया था. प्रोटीन Cy3 एनएचएस एस्टर के साथ लेबल किया गया था और LCP - FRAP पूर्व crystallization assays (चित्रा 2) में इस्तेमाल किया. मोटे ग्रिड कई LCP - FRAP assays के परिणामों से चयनित शर्तों पर आधारित स्क्रीन प्रारंभिक क्रिस्टल की तरह हिट (चित्रा 3) का उत्पादन किया. तेज़ शर्तों के आगे अनुकूलन विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल (चित्रा 4) मिले.
चित्रा 1 एक ठेठ LCP crystallization प्रयोग के प्रवाह चार्ट. ग्रे बक्से में कदम मौजूदा प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं हैं.
चित्रा 2. Monoolein आधारित LCP में β 2 AR-T4L/carazolol साथ परख LCP FRAP. ए) एक LCP - FRAP परख के परिणाम एक स्वचालित उच्च throughput मोड में प्रदर्शन किया, जिसमें एक 96 - अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक नमूना sequentially प्रक्षालित है और प्रतिदीप्ति वसूली के एक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद मापा जाता है. सभी 96 नमूनों के लिए प्राप्त प्रतिदीप्ति वसूली, जो प्रत्येक नमूने में मोबाइल अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं प्लॉट किए जाते हैं. स्क्रीनिंग समाधान एम 0.1 Tris 8 पीएच, 30% खूंटी / ध् ध् 400 दो अलग अलग सांद्रता में 48 अलग नमक के साथ संयुक्त होते हैं. बी) के कई प्रतिनिधि के लिए प्रतिदीप्ति वसूली प्रोफाइलresentative शर्तों. Eq द्वारा ठोस लाइन घटता फिट बैठता है प्रतिनिधित्व करते हैं. 1.The मोबाइल भिन्न और प्रसार गुणांक Eqs का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं. 1 और 2. ना क्लोराइड युक्त नमूना में कम से कम 10% की तेजी से वसूली fluorescently लेबल प्रोटीन के साथ सह शुद्ध लिपिड के कारण है.
चित्रा 3 β AR-T4L/carazolol 2 के प्रारंभिक क्रिस्टल हिट सबसे होनहार LCP - FRAP द्वारा की पहचान की शर्तों के चारों ओर एक मोटे ग्रिड स्क्रीनिंग के द्वारा प्राप्त सल्फेट ना युक्त (पैनल एक) और ना Formate ( पैनल बी).. प्रोटीन Cy3 एनएचएस एस्टर के साथ लेबल है और फ्लोरोसेंट छवियों 605 एनएम पर 543 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन का उपयोग कर लिया जाता है.
चित्रा 4 β 2 AR-T4L/carazolol के अनुकूलित क्रिस्टल. क्रिस्टल की छवियों ना सल्फेट की उपस्थिति में हो (एक पैनल और बी) और कश्मीर Formate (पैनल सी और डी) brightfield मोड (पैनल ए और सी) में ले रहे हैं और पार polarizers (पैनल बी और डी) का उपयोग.
Discussion
प्रोटोकॉल मुख्य meso crystallization प्रयोगों में प्रदर्शन में शामिल चरणों के लिए एक बुनियादी दृश्य मार्गदर्शन प्रदान करते हैं . में गहराई इन प्रोटोकॉल से संबंधित जानकारी, संभावित नुकसान पर बल, कमियों या वैकल्पिक मार्गों 1,2 कहीं उपलब्ध हैं. वैकल्पिक LCP FRAP assays के पहले चरण में मदद करने के लिए सबसे होनहार प्रोटीन का निर्माण, LCP मेजबान लिपिड और लिपिड additives, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभव precipitants और बफर शर्तों 3 की सीमा की सीमा का चयन कर सकते हैं. एक बार एक प्रारंभिक crystallization हिट पाया जाता है, यह करने के लिए बेहतर गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. Meso crystallization स्थितियों में अनुकूलन अनिवार्य रूप से अतिरिक्त पैरामीटर 1 LCP की संरचना के साथ जुड़े के अलावा के साथ घुलनशील प्रोटीन के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए समान है. झिल्ली प्रोटीन lipídic mesophase में बड़े क्रिस्टल आम तौर पर कर रहे हैं क्रिस्टल डिटर्जेंट समाधान में प्राप्त की तुलना में आकार में छोटी है, लेकिन अधिक का आदेश दिया है, इस प्रकार microfocus का उपयोग करने से दृढ़ता से benefitting आधुनिक सिंक्रोटॉन 6 स्रोतों पर उपलब्ध beamlines.
Meso स्थापना crystallization या परख प्लेटें, LCP FRAP assays के आयोजन और क्रिस्टल का पता लगाने सहित crystallization, में करने के लिए संबंधित प्रक्रियाओं के कई अर्ध या पूरी तरह से 1,2,8,9 स्वचालित किया गया है, की अनुमति स्थितियों की एक बड़ी रेंज की स्क्रीनिंग जबकि प्रोटीन और लिपिड की खपत छोटी मात्रा. दूसरी ओर, LCP और क्रिस्टल कटाई में प्रोटीन reconstitutions मैनुअल और अधिक थकाऊ संचालन रहते हैं और इस प्रकार, सुधार के लिए एक की जरूरत है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम भागों में एनआईएच GM073197 और RR025336 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
