Summary
プロトコルは、LCP結晶化試験と収穫結晶の設定、LCP - FRAPプリ結晶アッセイで初期条件を見つけることが、脂質キュービック相（LCP）におけるタンパク質の再構成から開始して膜タンパク質の回折品質結晶を得るために不可欠な手順を説明します。 。
Abstract
膜タンパク質は、形質導入、輸送、エネルギー変換を信号に関係する生体細胞内の重要な機能を実行し、そして、そのように、故障や病気の多くに関与している。しかし、膜タンパク質の構造と機能の理解が強く、主に、それらの水溶性パートナーのその背後にそれらの可溶化と回折品質結晶の生成に関連する問題のために遅れている。脂質中間相の結晶化は、（また、 メソ or LCP結晶でも呼ばれる）が正常に微生物ロドプシン、光合成タンパク質、外膜のβバレルとGタンパク質共役受容体の高分解能構造を得るために適用was有望な技術です。メソで結晶化は、ネイティブのような膜環境を活用し、一般的に低い溶媒含量と洗剤のソリューションから、従来の結晶に比べて、よりよい順序で結晶を生成します。方法は難しくありませんが、粘性の中間相の材料を処理する際の脂質の相挙動と実践を理解する必要があります。ここでは、事前に結晶化アッセイとから収穫結晶を行い、LCPを作成し、アッセイまたは結晶化プレートにLCPのナノリットルの一部を分配することによって続いて注射器のミキサーを使用してLCPの脂質二重層の膜タンパク質を、再構成のシンプルかつ効率的な方法を示していますLCPの行列。これらのプロトコルは、 メソ結晶化試験で近づくための基本的なガイドを提供しますが、任意の結晶化実験と同様に、広範なスクリーニングと最適化が必要であり、成功した結果は必ずしも保証されません。
Protocol
メソ結晶化実験での典型的な概要は図1,2に示されています。プレ結晶LCP - FRAPアッセイはオプションですが、彼 らは大幅に特に困難な膜タンパク質3の場合には、初期結晶化条件の検索プロセスを加速することができます。
1。 LCPにおけるタンパク質の再構成
- 洗剤溶液への関心の膜タンパク質を精製し、約10にタンパク質/界面活性剤複合体を集中- 20 mg / mLの、洗剤の1,4を介して、集中しないように注意しながら。
- 転送〜LCPホスト脂質（通常はモノオレイン）または40で1.5 mLのプラスチックチューブとインキュベートに脂質混合物25mgの° Cで数分間脂質が溶けるまで。
- 100μLガスタイトシリンジに注射器のカプラーを取り付けます。
- 調節可能なボリュームのピペットを用いて溶融脂質とシリンジをロードする。シリンジ内の脂質の量を記録。
- / Vタンパク質ソリューション対脂質比2 / 3のタンパク質溶液と、別の100μLシリンジをロードする対
- 注射器のカプラーを介して一緒に両方のシリンジを接続してください。
- 脂質の中間相が均一になるまで注射器は、前後に、カプラーの内側の針を介して脂質とタンパク質を移動するために交互にプランジャ押し込みます。 LCPは、機械的混合によって自発的に形成し、そしてタンパク質は、LCPの脂質二重層に再構成になります。 LCPの形成は、小角X線回折1を使用して 、可能であれば、クロス偏光板とを備えた顕微鏡で見たときに、その透明性とゲル状の整合性がとbirefringencyの不在によって検証、またはすることができます。
2。 LCP - FRAPプリ結晶化アッセイ
LCP - FRAPアッセイは、スクリーニングの条件3の様々な時にLCPの再構成膜タンパク質の拡散特性を測定するように設計されています。 LCPの膜タンパク質の長距離拡散が成功した結晶化に不可欠ですが、LCPの微細構造は、大規模なタンパク質やオリゴマータンパク質の凝集体の拡散を抑制します。 メソ結晶化実験での失敗の一般的な理由は、拡散の損失につながる高速タンパク質凝集です。それは、タンパク質の凝集挙動は、特定のタンパク質の構造、ホストの脂質とスクリーニングのソリューション3の組成に依存することが示されている。
- 〜100 / 1のタンパク質/色素比で蛍光色素（Cy3または類似の）とタンパク質にラベルを付ける、未反応色素を除去し、約1 mg / mLとするタンパク質を集中。遊離アミンまたは遊離チオールのいずれかにラベルを付けます。遊離アミンをラベリングする際、主に遊離のN -末端にラベルを付ける7と7.5の間のpHを使用してください。アミノ酸ラベリングも脂質蛋白質2,3と同じ場所に精製されたラベルを付けることができることに注意してください。
- 再構成するセクション1で説明したようにLCPで標識したタンパク質を）。
- セクション3に記載されているようではなく、結晶化スクリーン2のLCP - FRAPスクリーニングのソリューションを使用して）アッセイプレートを設定します。
- 20℃でプレートをインキュベートします平衡状態を達成するには、少なくとも12時間、暗所でC。
- よく10倍対物レンズを用いて初のオンLCP - FRAPステーションと焦点上プレートのある場所。
- 初期プリ漂白状態をキャプチャするために5蛍光画像を取得する。
- レーザーをトリガします。漂白スポットの真ん中に標識タンパク質の70％ - パルスのレーザパワーと番号は、漂白剤〜30に調整する必要があります。
- すぐにレーザーをトリガーした後、可能な限り高速なレートで約200画像の高速なポスト漂白シーケンスの記録を開始します。
- タンパク質の拡散速度に応じて、1〜20のように画像間の遅延を選択する、〜50枚の遅いポスト漂白シーケンスの録音で従ってください。
- すべてのフレームに漂白剤スポットの内部強度を統合し、レーザー漂白エリアの外の参照点の平均強度で漂白スポットの内部強度を割ることにより、集録中に漂白し、光強度の揺らぎのためにそれを修正する。
- 1に等しい事前に漂白強度は0に等しい初期漂白強度を確認するために修正された強度を正規化する。
- 以下の式5を使用して 、正規化強度対時間、F（t）の曲線を合わせる：
F（T）= M X EXP（- 2T / T）×（I 0（2T / T）+ I 1（2T / T））、（Eq.1）
Mは拡散分子のモバイル割合である、Tは特徴的な拡散の時間、tはそれぞれの記録されたフレームのリアルタイムです、I 0とI 1 0 番と1 番目のオーダー変形ベッセル関数である。 - として、拡散係数、Dを計算します。
D = R 2 / 4T、（Eq.2）
ここで、Rは、漂白スポットの半径である。 - tを移動する次もと繰り返します2.5）O - 2.13）。
- 別のスクリーニングの条件で得携帯フラクションと拡散係数を比較する。デザインの新しい結晶化は、タンパク質の拡散とタンパク質の拡散が観察されなかったため除く条件を容易にするコンポーネントに基づいて選別します。タンパク質がスクリーニングの条件のいずれかに拡散しなかった場合、スクリーニングのスペースを広げたり、新しいタンパク質が構築しようと検討してください。
3。 LCP結晶化トライアルのセットアップ
- 再構成するセクション1で説明したようにLCPのタンパク質を）。
- タンパク質を含んだ反復シリンジディスペンサーに取り付けられた10μLガスタイトシリンジにLCPを転送します。
- 10μLシリンジに短いリムーバブルニードル（ゲージ26、10 mmの長さ）を取り付けます。
- 2x2の正方形を形成する4つの隣接する井戸の表面にLCPの200 NLのボーラス投与を分注する。
- 対応する結晶の画面溶液1μLを持つLCPボーラス投与のそれぞれを重ねます。
- キャップの4つは18形のガラスのカバースリップをウェルの中にロードされます。井戸をシールするためにカバースリップ上に静かに押し込みます。
- プレート全体がいっぱいになるまで、4ウェルの次のセットで）手順3.4）-3.6を繰り返します。
- 定期的に結晶の形成と成長のためのチェック、一定温度でインキュベートする。
4。 LCPから収穫結晶
- 直線、回転偏光子と検光子を装備した可変ズームとステレオ顕微鏡、下のタンパク質結晶プレートを置きます。
- 全体がよくビューのフィールド内に配置されるように、低消費電力のズームを使って興味のあるもに焦点を当てる。
- セラミックキャピラリー切削石の鋭い角を使用しても境界線の内側の正方形を作成するための4ストロークでカバーガラスを得点する。
- カバーガラスの厚さによって傷を伝播する強力な鋭い点ピンセットで獲得した周囲に押してください。
- 得点の正方形の対角線上にあるパンチ二つの小さな穴。
- 後続の手順中に脱水症状を減らすために穴のいずれかを使用して沈殿剤溶液を数μLを注入する。
- 角度の鋭い針のプローブを使用すると、カットアウトの正方形を解放する1つまたは2つの側面に沿ってガラスを破る。
- 慎重にキュービック相のボーラスを監視ガラスの正方形を持ち上げます。ボーラスがカバースリップに付着されている場合は、井戸の底にガラスの上の正方形と場所を反転させる。
- 必要に応じてウェル内の露出キュービック相のボーラスの上に、、凍結保護剤を添加した沈殿剤溶液中の余分な数μLを、追加。
- 顕微鏡の倍率を増加させると、結晶に焦点を当てる。
- 収穫のループを参照するのに十分な光を保ちながら、偏光板と複屈折性結晶と背景のコントラストを高めるために、アナライザの間の角度を調整します。
- 結晶サイズに一致する直径MiTeGen顕微標本を選択し、顕微標本にそれをすくうことによりLCPから直接結晶を収穫。
- Flashは、液体窒素で収穫した結晶と顕微標本を凍結し、X線データ収集6のシンクロトロン光源のビームラインに発送して下さい。
5。代表的な結果：
人工ヒトβ2アドレナリンGタンパク質共役型受容体（β2 AR - T4Lは）バキュロウイルスSf9昆虫細胞に感染し、部分的インバースアゴニストカラゾロール7に束縛dodecylmaltoside（DDM）/コレステヘミサ（CHS）洗剤溶液で精製で発現させた。タンパク質をCy3 NHSエステルで標識し、LCP - FRAPプリ結晶アッセイ（図2）で使用されていました。 LCP - FRAPアッセイの結果から選ばれたいくつかの条件に基づいて、粗いグリッドの画面は、初期の結晶のようなヒット（図3）を製作。沈殿剤条件のさらなる最適化は、回折品質の結晶（図4）を得た。
図1典型的なLCPの結晶化実験のフローチャート。グレーのボックス内のステップは、現在のプロトコールに記載されていません。
モノオレイン基づくLCPのβ2 AR-T4L/carazololと図2。LCP - FRAPアッセイ。 A）LCP - FRAPアッセイの結果は、96ウェルプレートの各サンプルを順番に漂白され、蛍光の回復が30分間のインキュベーション後に測定される、自動ハイスループットモードで実行。各試料におけるモバイル分数を表す得られる蛍光の回復は、すべて96サンプルのためにプロットされます。スクリーニングのソリューションは、2つの異なる濃度で48の異なる塩と組み合わせて、0.1 MトリスpHを8、30％（v / v）のPEG 400が含まれています。 B）複数の担当者のための蛍光回復プロファイルresentative条件。実線の曲線は、式による近似を表す。 1。モバイルフラクションと拡散係数は、式を用いて決定されます。 1と2。ナトリウム塩化物を含む試料中の10％未満の高速リカバリは、蛍光標識脂質タンパク質と共精製さによるものです。
図3β2 AR-T4L/carazololの初期結晶のヒットは、硫酸Naは含まれている、LCP - FRAPによって識別された最も有望な条件の周りに粗いグリッドのスクリーニングによって得られた（パネル）およびNaギ（パネルB）。タンパク質をCy3 NHSエステルで標識し、蛍光画像は、605 nmで543 nmで励起し、発光を用いて撮影されています。
図4β2 AR-T4L/carazololの最適化された結晶。ナトリウム硫酸塩の存在（パネルAおよびB）で成長した結晶とKギ（パネルCおよびD）の画像は、明視野モード（パネルAおよびC）で撮影し、クロス偏光子を（パネルBおよびD）を使用している。
Discussion
プロトコルは、 メソ結晶化実験での実行に関連する主要な手順のための基本的な視覚的なガイダンスを提供します。深いこれらのプロトコルに関連する詳細、可能な落とし穴、欠点または代替ルートを強調するよりは、他の場所で1,2用意されています。オプションのLCP - FRAPアッセイは、最も有望なタンパク質の構造を選択するLCPのホストの脂質および脂質添加物だけでなく、可能な沈殿剤と緩衝液の条件3の範囲を制限するために以前の段階で役立ちます。初期結晶化ヒットが検出されると、それはより品質の高い結晶を得るために最適化する必要があります。 メソ結晶化条件での最適化は、LCP 1の組成物に関連付けられている余分なパラメータを追加することで可溶性タンパク質のための条件を最適化すると本質的に似ています。脂質中間相で成長した膜タンパク質の結晶は、通常、界面活性剤溶液中で得られた結晶よりも小型ですが、より現代的な放射光源6でマイクロフォーカスを使用してから強く恩恵を受け、そのため、利用できるビームライン命じた。
、結晶化またはアッセイプレートを設定するLCP - FRAPアッセイを行うと、結晶の検出を含むメソ結晶化、、 に関連する手順の多くは、できるように、1,2,8,9半または完全に自動化されている条件の広い範囲のスクリーニングタンパク質と脂質の消費する少量ながら。一方、LCPと結晶の収穫におけるタンパク質reconstitutionsは、マニュアルや面倒な操作が残ると、このように、改善の必要性を持っている。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金GM073197とRR025336によって部品で賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
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