Summary
프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .
Abstract
막 단백질은 전달, 운송 및 에너지 변환, 그리고 같은 고장과 질병의 다수 연루된다 신호에 관한 살아있는 세포에서 중요한 기능을 수행합니다. 그러나, 멤브레인 단백질의 구조와 기능 이해 강하게 인해 회절 품질 결정 자신의 solubilization 및 생성과 관련된 문제로, 주로 그들의 가용성 파트너의 뒤쳐지고있다. lipidic mesophases의 결정체 (또한 meso 또는 LCP 결정화에서라고도 함) 성공적으로 미생물 rhodopsins, 광합성 단백질, 바깥쪽 막 베타 두통 및 G 단백질 결합 수용체의 고해상도 구조를 얻기 위해 적용했던 유망 기술입니다. meso에 결정은 네이티브처럼 막 환경을 활용하고 일반적으로 낮은 용매 컨텐츠 및 세제 솔루션에서 전통적인 결정에 비해 더 나은 주문과 수정을 생산하고 있습니다. 방법은 어려운 것은 아니지만 점성 mesophase 자료를 취급하는 지질 위상 행동과 실천의 이해를 필요로합니다. 여기 LCP을하고, 분석 또는 결정화 판에 LCP의 nanoliter의 일부를 분배 미리 결정화 assays를 실시하고으로부터 결정을 수확하여 다음 주사기 믹서를 사용하여 LCP의 지질 이중층의 막 단백질을 reconstituting의 간단하고 효율적인 방법을 입증 LCP 매트릭스. 단, 결정화 실험, 광범위한 검사 및 최적화와 마찬가지로 필요하며, 성공적인 결과는 반드시 보증하지 않습니다,이 프로토콜은 meso의 결정화 실험의 접근에 대한 기본적인 가이드를 제공합니다.
Protocol
meso의 결정화 실험에의 일반적인 개요는 Fig.1 1,2로 표시됩니다. 사전 결정 LCP - FRAP의 assays은 선택 사항입니다 있지만, 그들은 크게 특히 어려운 막 단백질 3의 경우, 초기 결정화 조건 검색하는 과정을 가속하실 수 있습니다.
1. LCP의 단백질 Reconstitution
- 세제 솔루션에 대한 관심의 막 단백질을 정화하고 ~ 10 단백질 / 세제 단지 집중 - 20 MG / ML을 통해 - 집중 세제 1,4에 관심을 찍어.
- 전송 ~ LCP 호스트 지질 (일반적으로 monoolein) 또는 40 1.5 ML 플라스틱 관과 부화에 지질 혼합물의 25 MG ° C 몇 분 동안 지방질이 녹으까지.
- 100 μL 가스 기밀 주사기에 주사기의 커플러를 연결합니다.
- 조정 볼륨 피펫을 사용하여 용융 지질과 주사기를로드합니다. 주사기에있는 지방질의 볼륨을 기록합니다.
- 단백질 솔루션 - 투 - 지질 비율 3분의 2 V /에서 단백질 솔루션으로 앞으로 100 μL 주사기를 로드할 대
- 주사기의 커플러를 통해 함께 두 주사기를 연결합니다.
- 지질 mesophase가 균질 될 때까지 주사기가 앞뒤로, 커플러의 내부 주사 바늘을 통해 지방질과 단백질을 이동 번갈아 plungers 누르십시오. LCP는 기계적 혼합시 자발적으로 형성하고, 단백질은 LCP의 지질 이중층에 재구성된다. LCP의 형성은 작은 각도 X - 선 회절 1을 사용하여 가능하면 교차 polarizers 장착된 현미경으로 볼 때 그 투명성과 겔형 일관성에 의해 및 birefringency의 부재에 의해 검증, 또는 수 있습니다.
2. LCP - FRAP 사전 결정화 Assays
LCP - FRAP의 assays는 심사 조건 3 다양한에서 LCP의 재구성 막 단백질의 확산 특성을 측정하기 위해 고안되었습니다. LCP의 막 단백질의 장거리 확산은 성공적인 결정을 위해 필수적입니다 있으나, LCP의 미세 구조는 큰 단백질이나 oligomeric 단백질 집계의 확산을 constrains. meso의 결정화 실험에서 실패를위한 일반적인 이유는 확산의 손실로 이어지는 빠른 단백질 집합입니다. 이것은 단백질의 집계 문제는 특정 단백질 구조, 호스트 지질 및 심사 솔루션 3 구성에 따라 달라집니다 것으로 나타났습니다.
- ~ 1분의 100의 단백질 / 염료 비율에서 형광 염료 (Cy3 또는 이와 유사한 것)와 단백질을 분류, unreacted 염료를 제거하고 ~ 1 MG / ML에 단백질을 집중. 레이블 중 무료 아민 또는 무료 thiols. 무료 아민을 라벨 때, predominately 자유 N - 말단 레이블을 7과 7.5 사이의 산도를 사용합니다. 아미노산 라벨은 또한 lipids 단백질 2,3 공동 정화 레이블을 수있다는 점에 유의하십시오.
- Reconstitute로 제 1에서 설명한 LCP의 표시 단백질).
- 대신 결정화 화면 2 LCP - FRAP 검사 솔루션을 사용) 제 3에서 설명한대로 분석 번호판을 설정합니다.
- 20 접시를 품어 ° 평형 상태를 달성하기 위해 최소한 12 시간 동안 어둠 속에서 C.
- 10X 목표를 사용하여 잘 첫 LCP - FRAP 기차역과 집중 플레이스 접시 중 하나를.
- 처음 이전 표백 상태를 캡처 5 형광 이미지를 취득.
- 레이저를 트리거. 표백 지점의 중앙에 표시된 단백질의 70 % - 펄스의 레이저 전원과 전화 번호는 표백제 ~ 30으로 조정해야합니다.
- 바로 레이저를 실행 후, 가장 빠른 속도로 ~ 200 이미지의 빠른 사후 표백 시퀀스를 녹음 시작합니다.
- 단백질의 확산 속도에 따라 10-20의 이미지로 사이의 지연 시간을 선택 ~ 50 이미지의 느린 후 표백제 순서의 기록과 함께하십시오.
- 모든 프레임에있는 표백제 지점 내부의 강도를 통합하고 레이저 표백 영역 밖의 참조 지점의 평균 농도로 표백 현장 내부의 강도를 나누어 수집하는 동안 강도 변동을 표백과 빛을 위해 수정.
- 1 같은 사전 표백 강도와 0으로 동등한 초기 표백 강도를 확인하기 위해 수정된 강도를 정상화.
- 다음 방정식 5를 사용하고, 표준 강도 대 시간, F (t)의 곡선에 맞게 :
F (t) = M X EXP (- 2T / T) × (I 0 (2T / T) + I 1 (2T / T)), (Eq.1)
M은 diffusing 분자의 모바일 분수이고, T는 특성 확산 시간, T는 전 0 각 기록된 프레임의 실시간이며 1 0 회와 베셀 함수를 수정 제 1 순서입니다. - 확산 계수, D를 같이 계산 :
D = R 2 / 4T (Eq.2)
어디 R은 표백 지점의 반경이다. - t으로 이동2.13) - 다음 잘하고 단계를 반복 2.5) O.
- 다른 심사 조건 얻은 모바일 분수와 확산 계수를 비교합니다. 디자인 새로운 결정은 단백질 보급과 단백질 확산이 관찰되지 않은에 대한 제외 조건을 촉진하는 구성 요소에 따라 화면. 단백질은 검사 조건에도 확산하지 않은 경우, 심사 공간을 확대하거나 새로운 단백질 구조하려고 생각합니다.
3. LCP 결정화 평가판 설정
- LCP의 Reconstitute 단백질 등) 제 1에서 설명한.
- 반복 주사기 자동 지급기에 부착된 10 μL 가스 기밀 주사기로 단백질 라덴 LCP을 전송합니다.
- 10 μL 주사기로 짧은 이동식 바늘 (게이지 26, 10mm 길이)를 연결합니다.
- 2x2 사각형을 형성 네 인접한 웰스의 표면에 LCP 200 NL의 boluses 하는걸.
- 해당 결정화 화면 솔루션 1 μL와 LCP의 boluses 각 오버레이.
- 18mm 정사각형 유리 coverslip와 모자 네로드 웰스. 우물을 봉인하기 위해 coverslip에 부드러운 압력을 적용합니다.
- 전체 접시가 가득 때까지 네 우물의 다음 세트) 단계 3.4) -3.6를 반복합니다.
- 주기적으로 크리스탈 형성과 성장에 대한 확인, 일정한 온도에서 접시를 품어.
4. LCP에서 결정 수확
- 선형 편광 회전 및 분석기가 장착된 가변 줌과 스테레오 현미경으로 단백질 결정과 접시를 놓습니다.
- 평생 잘가 볼 분야 내에서 배치되도록 낮은 전력 축소를 사용하여 관심있는 잘 중점을 둡니다.
- 세라믹 모세관 절삭 석의 날카로운 모서리를 사용하여 잘 경계 안에 사각형을 만드는 네 뇌졸중의 coverslip 유리를 점수.
- coverslip 유리의 두께를 통해 흠집을 전파하기 위해 강한 날카로운 점 핀셋으로 득점 주위에 누르십시오.
- 점수 광장의 반대편 구석에 펀치 구멍이 작은.
- 이후 단계 동안 탈수를 줄이기 위해 구멍 중 하나를 통해 침전제 솔루션의 몇 가지 μL를 주입.
- 직각 날카로운 바늘 프로브를 사용하면 컷 아웃 광장을 무료로 하나 또는 두 개의 면을 따라 유리를하다.
- 조심스럽게 입방 위상 볼러스에 대한 유리 스퀘어 시청을 올려요. 볼러스이 coverslip에 붙어있다면, 우물의 바닥에 유리를 통해 광장과 장소를 플립.
- 와 보충 침전제 솔루션의 추가 몇 μL를 추가 cryo - protectant, 필요한 경우, 우물에 노출 입방 위상 볼러스 위에.
- 현미경의 배율을 증가하고 수정하는 데 중점을 둡니다.
- 수확 루프를 볼 수있을만큼 가벼운 유지하면서, 편광과 복굴절 결정과 배경 사이의 대비를 증가 분석기 사이의 각도를 조정합니다.
- 크리스탈 크기를 일치 직경 MiTeGen MicroMount를 선택하고 다음 MicroMount에 그것을 떠서하여 LCP에서 직접 크리스탈을 수확.
- 플래시 액체 질소의 수확 크리스탈 MicroMount을 동결하고, X - 레이 데이터 수집 6 싱크로 트론 소스 beamline로 보내주십시오.
5. 대표 결과 :
설계 인간 베타 2 아드레날린 G 단백질 결합 수용체 (β 2 AR - T4L)은 baculovirus sf9 곤충 세포를 감염 dodecylmaltoside (DDM) / 부분 역 작용제 carazolol 7 바운드 cholesteryl hemisuccinate (CHS) 세제 용액에 정화로 표현되었다. 단백질은 Cy3 NHS 에스테르로 표시하고 LCP - FRAP 미리 결정화 assays (그림 2)에 사용되었다. LCP - FRAP assays의 결과에서 선택한 여러 조건에 따라 거친 그리드 화면 초기 크리스탈처럼 조회 (그림 3)을 생산. 침전제 조건 추가 최적화 회절 품질 결정 (그림 4)를 굴복.
그림 1. 전형적인 LCP의 결정화 실험의 흐름 차트. 회색 상자에서 단계를 현재 프로토콜에서 설명하지 않습니다.
monoolein 기반 LCP의 β 2 AR-T4L/carazolol과 그림 2. LCP - FRAP 분석. A) LCP - FRAP 분석 결과는 96 - 웰 플레이트의 각 샘플이 순차적으로 표백하고 형광 복구는 30 분 보육 후에 측정되는, 자동으로 높은 처리량 모드에서 수행했습니다. 각 예제에서 모바일 분수를 나타내는 얻은 형광 recoveries은 모든 96 샘플 꾸몄다 있습니다. 심사 솔루션은 두 가지 다른 농도 48 다른 소금과 함께 0.1 M 트리스 산도 8, 30 % V / V PEG 400이 포함되어 있습니다. B) 여러 세일즈맨을위한 형광 복구 프로필resentative 조건. 실선 곡선은 EQ로 맞는를 나타냅니다. 1.The 모바일 분수와 확산 계수는 Eqs를 사용하여 결정됩니다. 1 2. 나 염화가 들어있는 예제에서 10 % 미만의 빠른 회복은 단백질과 함께 공동 정화 찬란 표시 lipids 때문입니다.
그림 3. β 2 AR-T4L/carazolol의 초기 결정 조회수가 황산 나 포함, LCP - FRAP 식별 가장 유망 조건 주위에 굵은 격자 심사에 의해 얻은 (패널 A)과 나 편대 (패널 B). 단백질은 Cy3 NHS 에스테르로 표시되고 형광 이미지는 605 nm의에서 543 nm의 여기에서와 방사를 사용하여 촬영하고 있습니다.
그림 4. β 2 AR-T4L/carazolol의 최적화 결정. (패널 A와 B) 나 황산의 존재에서 재배 결정의 이미지와 K 편대는 (패널 C와 D) 브라이트 모드 (패널 A 및 C)에서 찍은 상호 polarizers을 (패널 B와 D)를 사용하고 있습니다.
Discussion
프로토콜은 meso의 결정화 실험의 수행에 관련된 기본 단계에 대한 기본적인 시각 지침을 제공합니다. 심층의 가능한 함정을 강조 이러한 프로토콜에 관한 세부 사항 더, 결점이나 대안 노선은 다른 1,2 사용할 수 있습니다. 옵션 LCP - FRAP의 assays은 가장 유망한 단백질 구조, LCP 호스트 지질 및 지질 첨가제뿐만 아니라, 가능한 precipitants 및 버퍼 조건 3 범위를 제한을 선택합니다 이전 단계에서 도움이 될 수 있습니다. 초기 결정화 히트가 발견되면, 그것은 더 나은 품질의 결정을 얻기 위해 최적화해야합니다. meso의 결정화 조건의 최적화는 LCP 1의 구성과 관련된 추가적인 매개 변수의 추가와 함께 가용성 단백질에 대한 조건을 최적화하기 위해 본질적으로 비슷합니다. lipidic mesophase 재배 막 단백질 결정은 일반적으로 세제 용액에서 얻어진 결정보다 크기가 작은,하지만, 더 많은 현대적인 싱크로 트론 소스 6 microfocus를 사용 강하게 benefitting, 따라서 가능한 beamlines 명령했다.
, 결정 또는 분석 번호판을 설정 LCP - FRAP의 assays를 실시하고 결정을 감지 포함한 meso의 결정,에 관련된 절차의 대부분은 허용, 1,2,8,9 반 또는 완전히 자동되었습니다 조건의 큰 범위의 심사 단백질과 지방질의 소비 소량 동안. 한편, LCP 및 수정 수확의 단백질 reconstitutions 수동 더 지루한 작업을 유지하고, 따라서, 개선을위한 필요가있다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 GM073197 및 RR025336의 부품에 투자했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
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