Summary
Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .
Abstract
Zar proteinleri, sinyal iletimi, ulaşım ve enerji dönüşümleri, gibi çok sayıda arıza ve hastalıkların karıştığı ile ilgili canlı hücreler kritik işlevleri yerine. Ancak, membran proteinlerinin yapısal ve işlevsel bir anlayış güçlü kırınım kaliteli kristaller çözünürleştirme ve üretim ile ilgili zorluklar nedeniyle, özellikle, kendi çözünür ortakları geride kalıyor. Lipidik mesophases Kristalizasyon (mezo ya da LCP kristalizasyon olarak da bilinir), mikrobiyal rhodopsins fotosentetik proteinler, dış membran beta varil ve G-protein-bağlı reseptörler yüksek çözünürlüklü yapılar elde etmek için başarıyla uygulanmıştır gelecek vaat eden bir tekniktir . Mezo olarak kristalizasyon anadili gibi bir membran çevre yararlanır ve genellikle düşük solvent içeriği ve deterjan geleneksel kristalizasyon ile karşılaştırıldığında daha iyi sipariş ile kristaller üretir. Bu yöntem zor değildir, ancak, viskoz mesophase malzeme taşıma lipid faz davranışları ve pratik bir anlayış gerektirir. Burada LCP yapma ve bir membran proteini kullanarak LCP, bir tahlil veya kristalizasyon plaka LCP nanoliter bölümlerini dağıtım, kristalleşme öncesi testlerin yürütülmesi ve kristaller hasat bir şırınga mikser, çift katlı lipid yeniden oluşturmak basit ve verimli bir şekilde göstermektedir LCP matris. Ancak, herhangi bir kristalizasyon deneyi, geniş tarama ve optimizasyon gibi gerekli ve başarılı bir sonuç mutlaka garanti değildir; Bu protokoller mezo kristalizasyon çalışmalarda yaklaşan için temel bir kılavuz sağlar.
Protocol
Mezo kristalizasyon deneyde bir tipik bir anahat, Şekil 1'de 1,2 gösterilmiştir . Ön kristalleşme LCP sıkı bağlamak deneyleri isteğe bağlıdır, ancak, önemli ölçüde, özellikle zor zarı proteinleri 3 durumda, ilk kristalizasyon koşulları için arama sürecini hızlandırabilir .
1. LCP içinde Protein Sulandırma
- Bir deterjan solüsyona ilgi bir membran proteini arındırmak ve konsantre ~ 10 protein / deterjan kompleksleri - 20 mg / ml, aşırı-konsantre deterjan 1,4 bakım alarak.
- Transfer ~ 25 mg bir LCP ana lipid (genellikle monoolein) veya 40 1.5 ml plastik tüp ve inkübe bir lipid karışımı ° C'de birkaç dakika lipid eriyene kadar.
- 100 mcL gaz sıkı şırınga için bir şırınga coupler takın.
- Ayarlanabilir bir hacimde pipet kullanarak erimiş lipid şırınga yükleyin. Şırınga içinde lipid hacmi kaydedin.
- Bir protein çözüm-lipid oranı 2 / 3 v / protein solüsyonu ile başka bir 100 mcL şırınga Yük v.
- Birlikte her iki şırınga şırınga coupler üzerinden bağlayın.
- Şırınga, lipid mesophase homojen hale gelinceye kadar, ileri ve geri Kuplörün iç iğne ile lipid ve protein hareket dönüşümlü olarak pistonları itin. LCP mekanik karıştırma üzerine kendiliğinden formları ve protein LCP, çift katlı lipid sulandırılmış olur. LCP oluşumu, küçük açılı X-ışını kırınımı 1 ile çapraz polarize ile donatılmış bir mikroskop altında bakıldığında, eğer mümkünse, saydam ve jel gibi bir tutarlılık ve birefringency yokluğunda tarafından doğrulanmış, ya da olabilir.
2. LCP-sıkı bağlamak Ön kristalleşme Tahliller
LCP-sıkı bağlamak testlerin tarama koşulları 3 çeşitli LCP sulandırılmış membran proteinlerinin difüzyon özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. LCP zarı proteinleri uzun menzilli difüzyon başarılı kristalizasyon için gerekli, ancak LCP mikro büyük proteinler veya oligomerik protein agrega difüzyon kısıtlar. Mezo kristalizasyon deneyi bir başarısızlığı için ortak bir nedeni difüzyon kaybına yol açan hızlı bir protein agregasyonu. Bir protein toplama davranışı özellikle protein yapı, ev sahibi lipid ve tarama çözümü 3 bileşimi bağlı olduğu görülmüştür.
- Etiket, proteinin floresan boya ile (Cy3 veya benzeri) bir protein / boya ~ 100 / 1 oranında girmemiş boya kaldırmak ve ~ 1 mg / ml protein konsantresi. Etiket ya serbest aminler veya ücretsiz tiyoller. Ücretsiz aminler etiketleme, ağırlıklı olarak serbest N-terminalindeki etiket, 7 ve 7.5 arasında pH kullanın. Amino etiketleme lipidler co-saflaştırılmış protein 2,3 ile etiket farkında olun.
- Sulandırın 1. bölümde açıklandığı gibi LCP etiketli protein).
- Tahlil plakalar yerine kristalizasyon ekranlarında 2 LCP-sıkı bağlamak tarama çözümleri kullanarak) 3. bölümünde açıklandığı gibi ayarlayın.
- 20 plakalar inkübe ° C denge durumuna ulaşmak için en az 12 saat süreyle karanlıkta.
- 10x objektif kullanarak ilk LCP sıkı bağlamak istasyonu ve odak yerleştirin plakalar.
- Ilk ön-ağartılmış durumunu yakalamak için 5 floresan görüntüler elde.
- Lazer tetikler. Ağartılmış spot ortasında etiketli protein% 70 - çamaşır suyu ~ 30 bakliyat lazer gücü ve sayısı ayarlanabilir olmalıdır.
- Lazer tetikleme hemen sonra, mümkün olan en hızlı hızı ~ 200 resimler hızlı bir post-beyazlatma dizisi kaydetmeye başlamak.
- Protein difüzyon hızı bağlı olarak 1-20 sn gibi görüntüler arasında gecikme seçerek ~ 50 resimler, yavaş bir post-çamaşır suyu dizisi kaydı ile izleyin.
- Tüm çerçeveler içinde çamaşır suyu nokta yoğunluğu içinde entegre ve lazer ağartılmış alanının dışında bir referans nokta ortalama yoğunluğu, ağartılmış nokta içinde yoğunluğu bölerek satın alma sırasında yoğunluk dalgalanmaları ağartma ve ışık için doğru.
- 1'e eşit önceden ağartılmış yoğunluğu ve ilk ağartılmış yoğunluğu 0'a eşit yapmak için düzeltilmiş yoğunluk Normale.
- Aşağıdaki denklem 5 kullanılarak normalize yoğunluğu vs zaman, F (t) eğrisi Fit:
F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + 1 (2T / t)), (Eq.1)
M difüzyon moleküllerin cep fraksiyonu, T karakteristik difüzyon süresi mi, 0 kaydedilen her karenin gerçek zamanlı ve ben 1 0. ve 1. sırası Modifiye Bessel fonksiyonları. - Difüzyon katsayısı, D gibi hesaplayın:
D = R 2 / 4T (Eq.2)
R ağartılmış spot yarıçapı. - T Taşıo 2.13) yanında iyi ve adımları tekrarlayın 2.5).
- Farklı tarama koşulları için elde edilen mobil kesirler ve difüzyon katsayıları karşılaştırın. Tasarım yeni kristalizasyon protein difüzyon ve protein difüzyon görülmedi hangi hariç koşulları kolaylaştırılmış bileşenleri dayalı ekranlar. Protein ekranlı durumlardan herhangi diffüz olmadıysa, tarama alanı genişletilmesi veya yeni bir protein inşa çalışıyor düşünün.
3. LCP Kristalizasyon Denemeler Ayarlama
- LCP içinde sulandırın protein gibi) 1 bölümünde açıklanan.
- Protein yüklü LCP tekrarlayan bir şırınga dağıtıcı bağlı bir gaz sızdırmaz 10 mcL şırınga içine aktarın.
- 10 mcL şırınga, kısa bir çıkarılabilir iğne (gösterge 26, 10 mm uzunluk) takın.
- 2x2 bir kare oluşturan bitişik dört kuyu yüzeyinde LCP 200 nL bolus koyun.
- 1 mcL ilgili kristalizasyon ekran çözümü ile her LCP bolus Overlay.
- Cap dört bir 18 mm kare cam lamel yüklü kuyu. Kuyu mühür lamel üzerine nazik bir basınç uygulayın.
- 4 kuyu sonraki bütün plaka dolana kadar) 3.4) -3,6 adımları tekrarlayın.
- Kristal oluşumu ve büyümesi için periyodik olarak kontrol, tabak sabit bir sıcaklıkta inkübe edin.
4. LCP gelen Kristaller Hasat
- Doğrusal bir döner polarize ve analiz ile donatılmış bir stereo mikroskop altında değişken zoom ile protein kristalleri ile bir tabak koyun.
- Bütün iyi görüş alanı içinde yer almakta olup, böylece düşük güç zoom kullanırken ilgi iyi odaklanın.
- Keskin bir köşe, seramik kılcal kesme taş kullanılarak iyi sınırları içinde bir kare dört vuruş lamel cam Puan.
- Lamel cam kalınlığı boyunca çizikler yaymak için güçlü keskin nokta cımbız ile gol çevresinde basın.
- Punch iki küçük delik attı kare ters köşe.
- Yağışlı çözüm birkaç mcL sonraki adımları sırasında dehidrasyon azaltmak için bir delik aracılığıyla enjekte edilir.
- Açılı keskin bir iğne probu kullanarak cut-out kare serbest bırakmak için bir ya da iki tarafı boyunca cam kırmak.
- Kübik faz bolus cam kare izlenme dikkatlice yukarı doğru kaldırın. Bolus lamel sıkışmış ise, o kuyunun altındaki kare yer ve cam üzerine çevirin.
- Yağışlı bir çözüm ekstra birkaç mcL ile desteklenmiş bir cryo-Koruyucu, gerekirse, kuyu maruz küp faz bolus üstüne.
- Mikroskop büyütme artırın ve bir kristal odaklanmak.
- Hasat döngüsü görmek için yeterli ışık tutarken, birefringent kristal ve arka plan arasındaki kontrastı arttırmak için polarize ve analizör arasındaki açıyı ayarlayın.
- MiTeGen MicroMount kristal boyutu ile eşleşen bir çapa sahip bir seçin ve sonra MicroMount içine scooping LCP doğrudan kristal hasat.
- Flash sıvı azot hasat kristal MicroMount dondurma, ve, X-ışını veri toplama 6 için sinkrotron kaynağı beamline gemi .
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Bir mühendislik insan beta-2 adrenerjik G protein kenetli reseptör (β 2 AR-T4L) bakülovirüs sf9 böcek hücreleri enfekte dodecylmaltoside (DDM) / 7 carazolol kısmi bir ters agonisti bağlı kolesteril hemisuccinate (CHS) deterjan solüsyonu saflaştırılmış ifade edildi. Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testleri (Şekil 2) kullanılmıştır. LCP-sıkı bağlamak testlerinin sonuçları seçilen çeşitli koşullar dayalı Kaba ızgara ekranları ilk kristal gibi vurur (Şekil 3). Yağışlı koşullarının daha fazla optimizasyon kırınım kalite kristalleri (Şekil 4) vermiştir.
Şekil 1 tipik bir LCP kristalizasyon deneyi Akış şeması. Gri kutular Adımlar mevcut protokoller açıklanan değildir.
Şekil 2 monoolein tabanlı LCP β 2 AR-T4L/carazolol LCP-sıkı bağlamak tahlil. A) LCP-sıkı bağlamak testinin sonuçları, 96 plaka her örnek sırayla ağartılmış ve 30 dakika inkübasyondan sonra floresan kurtarma ölçüldüğü, yüksek verimli otomatik modda. Her bir numune mobil bölümünü temsil edilen floresan kurtarma, 96 numuneler için çizilir. Tarama çözümleri iki farklı konsantrasyonda az 48 farklı tuzları ile birlikte 0,1 M Tris pH: 8,% 30 v / v PEG 400 içerir. B) birkaç temsilcisi Floresan kurtarma profilleriresentative koşulları. Düz çizgi eğrileri Denklem tarafından uyuyor temsil eder. 1. cep kesirler ve difüzyon katsayıları Denklem kullanılarak belirlenir. 1 ve 2. ,% 10 daha az Na klorür içeren örnek hızlı iyileşme co-saflaştırılmış protein ile floresan etiketli lipidler nedeniyle.
Şekil 3 β 2 AR-T4L/carazolol ilk kristal hit LCP-sıkı bağlamak tarafından belirlenen en umut verici koşulları etrafında, sülfat Na içeren bir kaba ızgara tarama ile elde edilen (panel) ve Na biçimleri (panel). Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve 605 nm eksitasyon ve 543 nm dalga boyunda emisyon kullanarak floresan görüntüler alınır.
Şekil 4. β 2 AR-T4L/carazolol Optimize edilmiş kristalleri. (Paneller A ve B), Na sülfat varlığı yetiştirilen kristalleri ve K biçimleri (panel C ve D) görüntüleri aydınlık modu (paneller A ve C) ve çapraz-polarize (paneller B ve D).
Discussion
Protokolleri mezo kristalizasyon deneyler yapılması dahil temel adımlar için bir temel görsel rehberlik sağlar. Derinliği olası tuzaklara vurgulayarak, bu protokoller ile ilgili detaylar daha fazlası, bazı eksiklikler veya başka alternatif güzergahlar 1,2 mevcuttur. İsteğe bağlı LCP-sıkı bağlamak testlerin en çok gelecek vaat eden bir protein yapısı, LCP ana lipid ve lipid katkı yanı sıra mümkün precipitants ve tampon koşulları 3 sınırlandırmayı seçmek için önceki aşamalarında yardımcı olabilir. Ilk kristalizasyon isabet sonra, daha kaliteli kristaller elde etmek için optimize edilmelidir. Mezo kristalizasyon koşullarının optimizasyonu LCP 1 bileşimi ile ilişkili ilave parametrelerin ilavesi ile çözünür proteinler için iyi duruma getirmek için temelde benzer. Lipidik mesophase yetiştirilen Membran protein kristalleri genellikle deterjan solüsyonu elde edilen kristaller daha küçüktür, ama daha modern bir sinkrotron kaynakları 6 mikro fokus kullanarak güçlü yararlanarak, böylece mevcut beamlines emretti.
Kristalizasyon veya tahlil plakaları kurma LCP-sıkı bağlamak deneyleri yürüten ve kristaller tespit mezo kristalizasyon, ilgili prosedürlerin çoğu sağlayan, 1,2,8,9 yarı veya tam otomatik olan koşulları daha geniş bir yelpazede tarama protein ve lipid tüketen küçük miktarda. Öte yandan, LCP ve kristal hasat protein reconstitutions manuel ve sıkıcı işlemleri kalır ve böylece iyileştirilmesi için bir ihtiyaç var.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe GM073197 ve RR025336 parçalar halinde finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
