Summary
وتتميز التنمية في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة ، وذبابة الفاكهة السوداء البطن ، من قبل عدد من التغييرات شكل الخلية التي هي مناسبة تماما للنهج التصوير. هذه المادة سوف تصف الأدوات الأساسية والأساليب اللازمة لتصوير الأجنة الحية مبائر ذبابة الفاكهة ، وستركز على تغيير شكل خلية تسمى cellularization.
Abstract
البلدان النامية الجنين melanogaster ذبابة الفاكهة يخضع لعدد من التغييرات شكل الخلية التي هي قابلة للعيش عالية مبائر التصوير. يتغير شكل خلية في الذبابة هي مشابهة لتلك الموجودة في أعلى الكائنات الحية ، وأنهم يؤدون التشكل الأنسجة. بذلك ، في كثير من الحالات ، دراستهم له تداعيات مباشرة لفهم الأمراض التي تصيب البشر (الجدول 1) 1-5. على النطاق الفرعي الخلوية ، وهذه التغييرات شكل الخلية هي نتاج الأنشطة التي تتراوح بين التعبير الجيني لنقل الإشارة ، قطبية الخلية ، وإعادة تشكيل هيكل الخلية والاتجار الغشاء. وبالتالي ، فإن الجنين ذبابة الفاكهة يوفر ليس فقط في سياق تقييم يتغير شكل الخلية من حيث صلتها التشكل الأنسجة ، ولكن كما يوفر بيئة الفسيولوجية تماما لدراسة الأنشطة الفرعية الخلوية أن الخلايا الشكل.
وصف بروتوكول يهدف الى هنا صورة شكل خلية معينة تسمى cellularization تغيير. Cellularization هو عملية دراماتيكية غشاء البلازما النمو ، ويحول في نهاية المطاف إلى الجنين المخلوي الأريمة الخلوية. وهذا هو ، في الطور البيني من دورة الإنقسامية 14 ، غشاء البلازما invaginates في وقت واحد حول كل من نوى 6000 ~ رست cortically لتوليد ورقة من الخلايا الظهارية الابتدائي. العداد إلى الاقتراحات السابقة ، ليست مدفوعة من قبل الميوسين cellularization انقباض - 2 6 ، ولكن بدلا من ذلك إلى حد كبير وتتغذى بواسطة إيماس من الغشاء الداخلي من مخازن 7. وهكذا ، cellularization هو نظام ممتاز لدراسة الاتجار غشاء الخلية خلال التغييرات التي تتطلب شكل البلازما انغلاف الغشاء أو التوسع ، مثل الحرائك الخلوية أو عرضية - نبيب (T - نبيب) التشكل في العضلات.
علما بأن يتم تطبيق هذا البروتوكول بسهولة إلى التصوير من تغييرات أخرى في شكل خلية الجنين يطير ، ويتطلب تعديلات طفيفة فقط مثل تغيير مرحلة جمع الجنين ، أو باستخدام "الغراء الجنين" لتحميل الجنين في اتجاه معين (الجدول 1) 19/08. في جميع الحالات ، وسير العمل في الأساس نفسه (الشكل 1). وتستخدم الأساليب الموحدة لاستنساخ وtransgenesis ذبابة الفاكهة لإعداد مخزونات يطير المستقرة التي تعبر عن البروتين من الفائدة ، وتنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) أو مشتقاته ، وهذه الذباب توفير مصدر متجدد للأجنة. بدلا من ذلك ، يتم تقديمها مباشرة البروتينات الفلورية / تحقيقات في الأجنة تطير مباشرة عبر الحقن التقنيات المتناهية الصغر 9-10. ثم ، اعتمادا على الحدث التنموية وتغيير شكل خلية ليمكن تصوير ، يتم جمع الأجنة والتي قام بها التشكل على مجهر تشريح ، والمتمركزة في النهاية ومنصة لمرور الزمن على التصوير مبائر المجهر.
Protocol
1. تجميع الكؤوس جمع الأجنة
- قطع الجزء السفلي الخروج من الكأس ثلاثي الذرة 100 مل بشفرة الحلاقة ، مما يجعل من حافة بأكبر قدر من السلاسة. الكؤوس هي أسهل للتعامل مع تقليم إذا كنت أيضا الزوايا الثلاث الخروج من القمة ، رغم أن هذا ليس ضروريا على الاطلاق.
- قطع مربعة من اسلاك (6 سم × 6 سم). على طبق من قبل حرارة ساخنة ، داخل طبقة الدخان ، غطاء مربع شبكة سلكية على رأس قطعة من رقائق الألومنيوم الثقيلة. دفع خفض الحافة السفلى من كأس بشدة كي تستقر على شبكة الساخنة. انتظر بضع ثوان ، ورفع الكأس مع شبكة تعلق الآن. إذا احباط العصي أيضا ، مجرد قشور تشغيله.
- بارد الكأس بين عشية وضحاها. إزالة شبكة الزائدة مع مقص ، والرمال قبالة أي حواف حادة مع غرامة من الحبوب الصنفرة.
2. جعل لوحات أبل آجار عصير
- في قارورة 6L ، والجمع بين 100 غرام آجار Bacto دينار بحريني والماء المقطر 3L. الأوتوكلاف للأجار لمدة 30 دقيقة على وضع العادم بطيئة.
- في قارورة 2L مع التحريك ، والجمع بين السكروز 100 غرام ، 1L عصير التفاح ، و 6 ز حمض الهيدروكسي ف. الحرارة لدرجة الغليان الحل مع التحريك على طبق ساخن. لا تغلي لأكثر من 2 دقيقة. السماح للخليط من عصير التفاح لتبرد ، ثم قم بإضافة بقضيب للأجار. مزيج تماما.
- السماح لتبريد حل مجتمعة في 60 درجة مئوية قبل حمام ماء تتدفق 60x15 أطباق بتري ملم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مضخة تمعجية في صرف آغار. السماح لوحات لتبريد درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 ساعات. مكدس في حاويات Rubbermaid بطبقة من مناشف ورقية مبللة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظات :
- في الخريف أو الشتاء ، فإنه قد يكون من الضروري إضافة إضافي سعة 100 مل من الماء إلى آغار.
- العلامة التجارية للأطباق بتري المهم! فقط فالكون الأطباق دينار بحريني تناسب الأكواب ثلاثي الذرة. ويمكن الاطلاع على معلومات محددة في جدول ترتيب المواد أدناه.
3. إضافة الذباب GFP لكأس كوكتيل الأجنة
- توسيع GFP الأسهم وفقا لاحتياجات المجموعة الخاصة بك عن طريق إنشاء زجاجات من الذباب حوالي أسبوعين قبل التصوير. زجاجة واحدة من الذباب هو عادة أكثر من كافية لملء كوب واحد جمع الأجنة مع حد أدنى من 50 من الإناث والذكور 30. للحصول على أفضل وضع ، وينبغي أن يكون الذباب eclosed حديثا (أي أقل من 5 أيام بعد الفقس).
- جعل لصق الخميرة عن طريق ملء فنجان صغير مع الأحمر أجزاء متساوية تقريبا الخميرة الجافة النشطة ستار والماء المقطر ، ويحرك حتى يذوب الخميرة. يجب أن لصق التقريبية اتساق زبدة الفستق الرطب. يمكن إضافة المزيد من الخميرة أو الماء لتغيير الاتساق. ويمكن استخدام لصق الخميرة لعدة أيام ، وينبغي أن تكون مخزنة ، وتغطيتها ، في 4 درجات مئوية.
- بمجرد لصق الخميرة جاهزة ، وإزالة لوحات عصير التفاح من 4 درجات مئوية التخزين. خط عصير التفاح مع لوحات لصق الخميرة ، والسماح لهم بحرارة 22-25 درجة مئوية ، مما يشجع على وضع البيض.
- أمثال ورقة في نصف دائرية التصفية ، ثم في النصف مرة أخرى. تقليم إلى قطرها 8-9 سم ، وجعل طيات الأكورديون في ربع دائرة. تتكشف الدائرة ، عكس ذلك ، وأدخله في كوب جمع حتى يلمس شبكة. تأكد من أن ورقة آمن في الكأس بحيث لا تقع وسحق الذباب. ورقة تصفية اختيارية ، ولكنها لا توفر بيئة مرحبة للتزاوج ، ويحافظ على الرطوبة في الكأس.
- تسمية الكأس مع اسم وتاريخ البورصة. نقل الذباب من القنينة لكأس جمع عن طريق هز الزجاجة برفق مقلوب على الكأس ، وتغطية مباشرة الكأس مع لوحة إعداد عصير التفاح. لوحة لتأمين الكأس مع الشريط المطاطي. مجموعة فناجين الجانب شبكة تصل في منطقة مع الضوء المباشر. تأكد من عدم سقوط الظلال على الكأس ، والذباب لا تكمن أيضا في الظلام.
- تغيير لوحة عصير التفاح عند الحاجة. مجموعات لمدة ساعتين ، في درجة حرارة الغرفة ، وتعمل بشكل جيد لcellularization التصوير.
4. إعداد غرفة التركيب
- لإعداد غرفة المتصاعدة للأجنة ، وقطع قطعة من الشريط على الوجهين 2-3 سم طويلة وضعها على شريحة والتوفيق بين المحور طويلة من الشريط والشريحة. قطع الثانية 2-3 سم قطعة طويلة من شريط مزدوج الوجه وطبقة على رأس من قطعة أخرى من الشريط ، والتأكد من محاذاة حوافها.
- باستخدام شفرة حلاقة ، وجعل اثنين من التخفيضات حوالي 3 ملم أشلاء في وسط الشريط وعمودي على محور طويل من الشريحة. إزالة الشريط بين التخفيضات لجعل القناة. الماصة قطرة من النفط 27 الهالوكربون في القناة. هذه القناة هو المكان الذي يقام الأجنة.
ملاحظات :
- فقط سكوتش بوصة ونصف على الوجهين الشريط هو سمك الحق في استيعاب أجنة.
- والنفط هو 27 الهالوكربون نفاذية الأكسجين ، ويسمح ذلك تبادل الأكسجين ، في حين منع الجفاف الجنين. نظرا لمعامل الانكسار والخمسين ، والنفط هو 27 الهالوكربون أيضا مثالية للانطلاقوالتصوير الأجنة.
5. Dechorionate الأجنة
- لجمع واجنة dechorionate ، صب ما يكفي من مواد التبييض 50 ٪ على لوحة عصير التفاح أغار إلى غمر كامل السطح بأكمله. باستخدام مجهر تشريح ، مثل اكتشاف V8 زايس مع الضوء المنقولة ، ومشاهدة للأجنة لإطلاق سراح من المشيماء بهم. حالما يحل المشيماء والنشرات من الاجنة قليلة (30-60 ثانية) ، من أجل تبييض والأجنة في مصفاة الخلية.
- غسل الأجنة في مصفاة فورا وبقوة مع الماء المقطر من زجاجة بخ. الداب مصفاة على مناشف ورقية. إذا رأيت أي الوردي على منشفة بعد اللمس ، لا تزال غسل الأجنة مع الماء.
- استخدام الفرشاة رطبة لنقل الأجنة إلى 10-50 طبق نظيف عصير التفاح (مع عدم لصق الخميرة). ذبالة بعيدا المياه مع حافة ممزقة منشفة ورقية ، وتغطي على الفور الأجنة مع كمية صغيرة من النفط 27 الهالوكربون.
ملاحظات :
- لا تستخدم كلوروكس التبييض. بدلا من ذلك ، استخدام العلامة التجارية مثل بليتش A - 1 أوستن التجاري ، والذي هو <هيبوكلوريت الصوديوم 6 ٪.
- الإفراط في التبييض أو عدم كفاية الشطف سيؤدي في الأجنة طري مع cellularization غير النظامية.
6. مرحلة الأجنة وجبل
- باستخدام مجهر تشريح مع ضوء المحالة ، واتباع الإرشادات المورفولوجية Bownes من 20 إلى مرحلة الأجنة على طبق من ذهب. باستخدام الملقط ، ونقل 5 الإنقسامية دورة 11 أو 12 الأجنة ، المقابلة لمرحلة Bownes 4 ، قناة للغرفة في تصاعد مستمر. ترتيب الأجنة في خط مع الجانب الظهري والبطني الجانبين مرئية والجانبية إلى أسفل. رتبت بسهولة الأجنة في هذا التوجه في مجال النفط وحده. لا الحشد الأجنة معا لأنها سوف تحرم جيرانهم من الأكسجين بمجرد تطبيق زلة تغطية أدناه. (اترك حوالي نصف طول الجنين بينهما).
- ويكمن أحد حافة غطاء 25x25 ملم زلة على الشريط على الوجهين في جانب واحد من القناة. إسقاط زلة غطاء لتغطية القناة. إذا اشتعلت الهواء تحتها ، تنطبق على كمية صغيرة من النفط في 27 الهالوكربون على حافة الانزلاق الغطاء. وعمل شعري سحب النفط في القناة واخراج الهواء.
ملاحظات :
- مورد آخر ممتاز للأجنة التدريج هو ما يلي : كامبوس أورتيغا ، JA وHartenstein ، V. (1985). التطور الجنيني للmelanogaster ذبابة الفاكهة. سبرينغر ، دار نشر ، برلين. بينما لم يعد نشر هذا الكتاب ، وتتوفر نسخ تستخدم بانتظام على Amazon.com.
- دائما استخدام النفط الهالوكربون 27 ماما. وهذا سيجعل من السهل تركيب. فإنه سيتم أيضا منع عرضي ناز من النفط نحو الهدف المجهر في الخطوات التالية التصوير.
7. صورة الجنين
- كيف سوف تمضي هنا بالطبع أن تمليها الخلية تغيير الشكل الذي كنت التصوير ، والسؤال الذي كنت معالجة. عن أي تغيير الشكل ، ومكان الغرفة الخاص المتزايدة على المجهر an إما رأسي أو مقلوب ، والعثور على الأجنة التي تنتقل عن طريق الضوء ، ومن ثم التحول إلى التصوير مبائر للتركيز على منطقة الفائدة. الالتزام بأفضل الممارسات للفحص المجهري متحد البؤر ، مثل تلك التي نوقشت في MicroscopyU نيكون ( http://www.microscopyu.com/articles/confocal ). أن يكون بالغ الدقة في الكشف عن الأجنة الحية الخاص إلى السلطة ليزر أقل قدر ممكن ، لمنع photobleaching والضيائية.
- لcellularization ، فإننا صورة على 710 زايس مجهر ليزر متحد البؤر المسح الضوئي ، وذلك باستخدام C - امزيغ 40x/1.2 الهدف كور W. يقع هذا المجهر في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر عليها ، مع درجات حرارة تتراوح بين 18-20 درجة مئوية. بينما يتم التحكم في درجة الحرارة ليس ضروريا على الاطلاق ، فمن الأفضل للمجهر ويجعل التصوير أكثر اتساقا. نحن بانتظام صورة في طائرة واحدة ، بالقرب من وسط جنين ، لمتابعة invaginations غشاء البلازما في المقطع العرضي (الشكل 2). ببساطة لمتابعة ديناميكية انغلاف ، 30-60 فترات الثانية هي كافية لمرور الزمن والتصوير ، ويجب أن تحمل أجنة التصوير لمدة 90> مع عدم وجود علامات واضحة على الحرمان الأوكسجين.
- بعد الحصول على الصور ، يمكن تحليل ما به أي عدد من حزم تحليل الصور ، بما في ذلك مجانية من المعاهد الوطنية للصحة ، ودعا ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij ). ثم يمكن أن تكون البيانات كما عرضت أفلام (فيلم 1) ، وتسلسل (الشكل 2) ، أو kymographs 21.
ملاحظة :
- الماء الغمر C - امزيغ 40x/1.2 الهدف كور دبليو مناسبة تماما للتصوير بالقرب من جنين في منتصف القسم بسبب الفتحة العالية ، الأمر الذي يحد من الانحرافات عن التصوير في عينات الأنسجة العميقة مائي ، ويعطي إشارة وارتفاع القرار الفلورسنت عالية. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الهدفوعلى مسافة طويلة جدا العمل (220 ميكرون). ومع ذلك ، فإن الأهداف الأخرى الغمر بالمياه أو الغليسيرين أداء جيدا ، خصوصا إذا يمكن تصويرها على تغيير شكل خلية من الفائدة بالقرب من سطح الجنين.
8. الطريقة البديلة : جبل الأجنة مع "الغراء الجنين"
- صورة لخلية تغيير شكل غير cellularization ، فإنه قد يكون من الضروري تحميل الأجنة في اتجاه معين لا يمكن الحفاظ عليها في النفط وحده. للقيام بذلك ، استخدم أسلوب بديل لتركيب واحد هو موضح سابقا. بداية بجعل "جنينية الغراء" عن طريق الجمع بين 20 سم من الشريط على الوجهين مع 250 ميكرولتر من هيبتان في قارورة التلألؤ. ضع قارورة التلألؤ على nutator أو منصة دوارة ، وتخلط بين عشية وضحاها.
- تراجع تلميح ماصة الغراء الأصفر في جنين ، وتتبع بعد ذلك الطرف على طول الشريحة ، وترك وراءه العديد من الغراء. في حين أن هيبتان تتبخر ، محاذاة الخاص نظموا الأجنة في الاتجاه المطلوب على كتلة من آغار. (تذكر أن السطح ليمكن تصوير الجنين يجب أن تواجه آغار ، فعلى سبيل المثال ، لتغيير شكل صورة الخلية خلال تشكيل ثلم بطني ، جبل الأجنة مع جانبهم بطني التي تواجه آغار).
- عكس الشريحة مع الغراء ، ثم اضغط برفق على درب من الغراء على الأجنة على كتلة آغار. الآن عكس الشريحة مرة أخرى. وسوف يكون عالقا الأجنة في الاتجاه المناسب. إضافة طبقتين من الوجهين على جانبي الشريط من الأجنة ، وغطاء لهم النفط 27 الهالوكربون ، وتطبيق ساترة. المضي قدما في التصوير على النحو المبين أعلاه.
9. ممثل النتائج :
إذا أجنة أصحاء والتصوير هو الأمثل ، ومن ثم ينبغي اتخاذ cellularization 50-60 دقيقة ، وينبغي invaginations غشاء البلازما دخول ما يقرب من 40 ميكرون. ومع ذلك ، إذا كان ما يزيد على الأجنة ، ابيض ، الأوكسجين المحرومين أو تضررت من الضيائية ، ثم انغلاف بطء أو توقف ، ولا سيما في مجال تصوير. تدهور صحة الجنين مثل هذه النتائج في كثير من الأحيان في التنمية تتغير والفشل كما أن يفقس اليرقات. وهكذا ، لإجراء اختبار صارم على صحة الجنين بعد الفحص والتصوير ، والحفاظ على الشرائح الخاصة بك في غرفة ترطيب ومشاهدة للتفقيس في اليوم التالي.
الشكل 1. سير العمل من جمع الجنين الى التصوير ، ويمكن تقسيم العمل على البروتوكول إلى أربع مراحل رئيسية. في المرحلة الأولى ، يتم تحضير جميع المستلزمات الفردية ومكوناتها ، ومن ثم يتم وضع الجنين جمع كوب عصير التفاح ، لوحة آغار وGFP الذباب معا لخلق بيئة زرع الجنين. في المرحلة الثانية ، يتم جمع البيض والأجنة التي وضعت على لوحات أجار عصير التفاح. يقام في المرحلة الثالثة ، يتم إزالة أجنة من لوحة ، ونقل إلى غرفة في تصاعد مستمر. في المرحلة الرابعة ، يتم تصوير الأجنة التي شنت على مبائر المجهر.
الشكل 2. هي التي شنت بيانات تمثيلية من الوقت الفاصل بين التصوير من cellularization. الأجنة مع الظهرية (D) والبطنية (V) الجانبين واضحة للعيان ، ويتم تصويره بالقرب من منتصف لمتابعة invaginations غشاء البلازما في المقطع العرضي. الجنين هو موضح هنا يعبر عن GFP - الميوسين - 2 6 المسبار ، الذي يركز على نصائح من invaginations غشاء البلازما. وهكذا ، وتتبع ingression هذه الجبهة مع مرور الوقت يعطي المعدل الذي غشاء البلازما invaginates. نقطة الساعة 0:00 دقيقة يتوافق مع ظهور cellularization. بعد وقت قصير من الساعة 56:00 دقيقة نقطة ، تكون المعيدة يبدأ على الجانب البطني للجنين. شريط 40 ميكرون.
الفيلم 1. الفيلم الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من cellularization هذا الفيلم يتوافق مع الشكل 2. لتسجيل كامل عملية cellularization ، بدأ التصوير في دورة الإنقسامية قبل 13 ، واستولت على pseudocleavage الانحدار ثلم ، واستمرت حتى شوهدت تحركات تكون المعيدة في الجانب البطني للجنين. وقد تم جمع الصور في أحد فترات دقيقة. وزادت شدة ما بعد الاستحواذ لجعل من السهل أن نرى تحركات تكون المعيدة.
انقر هنا للحصول على الفيلم
| * التنموية الحدث والتوقيت | يتغير شكل الخلية ذات الصلة | وصلة للمرض أو صحة الإنسان | الأخيرة إشارات يعيش مع التصوير |
| تشطر شبه تشكيل ثلم (4 و 90 دقيقة PF) | الحرائك الخلوية | تعدد الصيغ الصبغية وسرطان التقدم 1 | Mavrakis وآخرون ، 2009 8 تساو وآخرون ، 2010 9 |
| Cellularization (5 ؛ PF 130 دقيقة) | الحرائك الخلوية | تعدد الصيغ الصبغية وسرطان التقدم 1 | تساو وآخرون ، 2008 10 وSokac Wieschaus ، 2008 11 |
| تشكيل بطني ثلم ؛ انغلاف الأديم المتوسط (6 ؛ PF 180 دقيقة) | قمية انقباض ؛ طلائي - الوسيطة التي تمر بمرحلة انتقالية | سرطان الانبثاث 2 | الثعلب وPeifer ، 2007 12 مارتن وآخرون ، 2009 13 |
| Germband التمديد (7 ، 195 دقيقة PF) | المتقاربة التمديد | 3 عيوب الأنبوب العصبي | Bertet وآخرون ، 2004 14 بلانكنشيب وآخرون ، 2006 15 |
| Tracheogenesis (11 و 320 دقيقة PF) | الظهارية تشكيل الأنابيب والمتفرعة | 4 الأوعية الدموية | Caussinus وآخرون ، 2008 16 جيرفيه وكازانوفا ، 2010 17 |
| إغلاق الظهرية (14 ؛ 620 دقيقة PF) | قمية انقباض | التئام الجروح 5 | Gorfinkiel وآخرون ، 2009 18 سولون وآخرون ، 2009 19 |
الجدول 1 أمثلة على تغيرات شكل الخلية في تصوير الأجنة الحية يطير
* المرحلة Bownes عدد وزمن ما بعد الإخصاب (PF) ، عندما يبدأ كل حدث ، يتم سرد وفقا لكامبوس أورتيغا ، 1985.
| يطير الأسهم | التسميات | المرجع الأصلي |
| العنكبوت GFP (95-1) | غشاء البلازما | مورين وآخرون ، 2001 22 |
| Resille - GFP (117-2) | غشاء البلازما | مورين وآخرون ، 2001 22 |
| GAP43 - فينوس | غشاء البلازما | Mavrakis وآخرون ، 2009 8 |
| السباغيتي الاسكواش - GFP (Sqh - GFP) | الميوسين - 2 | Royou وآخرون ، 2002 6 |
| E - كادهيرين - GFP (ECAD - GFP) | خلية خلية تقاطعات | أودا وآخرون ، 2001 23 |
| GFP - Moesin | F - أكتين | Kiehart وآخرون ، 2000 24 |
| Utrophin ، الزهرة (فينوس Utro -) | F - أكتين | Sokac وآخرون ، لم تنشر النتائج |
الجدول 2. مخزونات مفيدة لتغيير شكل خلية التصوير في أجنة ذبابة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف بروتوكول هنا سوف تسمح للعيش ، والتصوير مبائر عدد من التغييرات شكل خلية في جنين ذبابة النامية. يمكن أن تكون على استعداد لتصوير GFP الأسهم من قبل مختبر الفردية (الجدول 2) ، ولكن العديد من هذه الأسهم هي أيضا متاحة للجمهور من مراكز مثل مركز ألبوم بلومينغتون ذبابة الفاكهة في جامعة إنديانا ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) وصائدة الذباب مركز الأسهم في جامعة ييل ( http://flytrap.med.yale.edu ). ويمكن الحصول عليها مرة واحدة ثم تصوير هذه البيانات يجب إقران يعيش مع التحليل الكمي لتحديد بدقة وظائف البروتين ، والأنشطة الفرعية الخلوية ، والمعايير الفيزيائية الحيوية التي تغير شكل محرك الخلية والأنسجة التشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان اريك Wieschaus ، الذين قدموا الأساس الذي وضعت هذا البروتوكول. ويدعم عملنا في وزارة ماكلين فيرنا Marrs والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية البدء الجائزة ، كلية بايلور للطب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Cover slips 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Scintillation vials with caps | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Yellow pipet tips | Rainin | L200 | |
| Stainless steel mesh, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 Filter paper | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Rubber bands | Office Max | A620645 | |
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Razor blades | VWR international | 55411-050 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | |
| Paper towels, C-fold | Kleenex | ||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
