Summary
تحقيق وتطبيق القياسات المباشرة للقوات على الخلايا العصبية في نطاق microdyne 2000-1000 بدقة عالية باستخدام الإبر الزجاجية معايرة. ويمكن استخدام هذه المنهجية لمراقبة وقياس جوانب عديدة من التنمية المحاور ، بما في ذلك الشروع المحاور ، المحاور التوتر ، سرعة استطالة محواري ومتجهات القوة.
Abstract
ويمكن تحقيق التلاعب الخلية وتوسيع محاور الخلايا العصبية مع زجاج معايرة الدقيقة الألياف قادرة على قياس وتطبيق القوات في نطاق 1،2 1-10 μdyne. ويتم الحصول على قياسات القوة من خلال الملاحظة من Hookean الانحناء من الإبر والزجاج ، والتي هي محسوبة من الطريقة المباشرة والتجريبية 3. موصوفة بشكل كامل الاحتياجات من المعدات وإجراءات لافتعال ، ومعايرة ، وعلاج ، واستخدام الإبر على الخلايا. قوة الأنظمة أنواع الخلايا المستخدمة سابقا والمختلفة التي طبقت هذه التقنيات إبداء المرونة في المنهجية وتعطى كأمثلة عن التحقيق في المستقبل 4-6. مزايا التقنية هي مستمرة "تصور" للقوات التي تنتجها التلاعب والقدرة على التدخل مباشرة في مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية. وتشمل هذه التحفيز المباشر وتنظيم النمو وانكماش محواري 7 ، وكذلك القياسات الميكانيكية ومفرزة على أي نوع من الخلايا المستنبتة 8.
Protocol
1. الإبر صنع الزجاج.
- يتم استخدام إبرة قابل للتعديل الجزئي مجتذب الى افتعال الإبر مع طرف مدبب حوالي 4 ملم طولا والتي هي مغلقة الكمرات الصلبة. خلافا لنصيحة مرنة طويلة ، وهذا باختصار طول حدود 4 مم الاهتزازات من طرف الإبرة خلال التجارب. في المنطقة القريبة من الألياف 4 ملم ، والإبرة يضمحل بسرعة من قطر الأنبوب الزجاجي إلى 15 ميكرومتر في حدود 1 ملم ، في حين أن القاصي أقصى 1 ملم من الألياف هو 2.5 ميكرون في القطر. نستخدم الأنابيب الشعرية R - 6 الزجاج ، OD 0.9 ملم ، 0.6 ملم معرف طول 8 "ومجتذب BB - CH. إذا كان المحقق مهتمة في قياس مدى قوة أخرى ، والإبر مع خصائص مختلفة الربيع (أي لمدة مختلفة وأو ينبغي سحب) سمك كل أنبوب شعري يسحب إلى أربع إبر "(2). يتم تخزين الإبر في تغطية 160 مم مع أطباق بتري "الثعابين' اثنين من الطين في النمذجة التي ضغطت بخفة الإبر.
- الإبر والزجاج ، فضلا عن إبرة في سلك يمكن وصفها ، هي أساسا تستخدم أشعة الينابيع الثني من صلابة مناسبة للقياسات المطلوبة للقوة. علما بأن القوة لثني شعاع جداول كما المكعب من طوله ، بغض النظر عن تكوينها. وهكذا ، على أي من الخطوات المذكورة أدناه المعايرة ، يمكن جعل شعاع إبرة / أشد صلابة غير كافية من جانب كمية صغيرة من تقصير (على سبيل المثال 10 ٪ تقصير ينتج عن زيادة 28 ٪ في الصلابة ، أي 0.9 3).
2. القرارات ومعايرة إبرة الأسلاك
- جعل إبرة المعايرة سلك طريق إدخال سلك 0،001 Chromel "من خلال إبرة داخل الزجاج (مصنوعة في القسم 1.1) مع قطع طرفها. سحب السلك من طرف إلى طول 26 مم والغراء في مكانه مع سوبر الغراء. بيند البعيدة 1 ملم من السلك الى هوك.
- جعل الدقيقة الأوزان من 1 متر من الأسلاك 0،003 Constantan ". قياس الأسلاك ، وشريط لعصا متر للمساعدة في الحصول عليه مباشرة قدر الإمكان. زن م 1 من الأسلاك ، وقطع بدقة على قطعة 1 سم ، والانحناء العديد من القطع في مقابل
- معايرة الإبر سلك يتطلب تشريح المجهر مع شبكاني قياس وmicromanipulator ملف. إمالة المجهر 90 درجة على جانبها باستخدام موقفا ازدهار عالمي ، بحيث يمكن ملاحظة وجود انحراف النزولي للإبرة السلك. جبل الإبرة الاسلاك 2.1 في المقطع حامل الأداة على micromanipulator ان هذه المنطقة المعقوف هو عمودي على المحور البصري للالمجهر. حتى خط ربط الإبرة من الأسلاك مع علامة شبكاني. يتعطل 1 سم الوزن الجزئي على هوك وسجل انحراف. ويحسب ثابت الانحناء (μdynes / ميكرون) من الأسلاك المرجعية باعتبارها نسبة من الوزن الجزئي (لاحظ : 1 = 0.98 ملغ dynes) مقسوما على انحراف ولاحظ (ميكرون). لإعداد الإبرة الأسلاك للخطوة التالية ، وقطع ورطتها في نقطة تزن مع مشرط. وجود ربط والوزن الإضافي الذي ينحني السلك إلى درجة صغيرة. وبالتالي فإنه موقف الآثار الأولية للسلك في شبكاني قبل إضافة الوزن. مشتق قياس السلك المستمر الربيع من انحراف السلك عندما يتم إضافة وزن إلى نقطة منحنى (نصيحة مستقبل السلك). عندما يتم قطع خطاف أنه لا تغيير في ربيع دائم من السلك.
3. معايرة الإبر والزجاج وسيطة
- المعايرة من الإبر والزجاج وسيطة يتطلب استخدام مجهر مقلوب مع شبكاني العين. على جانب واحد للمرحلة المجهر هو micromanipulator الميكانيكية المستخدمة لاجراء الإبرة الاسلاك الباب 2 في وسط الحقل البصري. على الجانب الآخر هو micromanipulator ثلاثة محاور هيدروليكية (انظر الجدول المعدات) تستخدم لتحريك الإبرة الزجاج وسيطة يتم معايرة. باستخدام micromanipulators ، وجلب كل من الإبر معا في وسط الميدان البصري بزاوية 45 درجة ~ الى 160 ملم × 30 ملم طبق بيتري من الماء في حقل 10X.
- للمرة الأولى هي سلسلة من الإبر وانسحب مع إعدادات مختلفة على مجتذب ماصة للتقييم. والهدف هو جعل إبرة الزجاج وسيطة مع الربيع الانحناء ثابتة من 20-30 μdynes / ميكرون. ويتم تحديد صلابة عن طريق قياس نسبة انحراف الإبرة المتوسطة بالمقارنة مع انحراف الإبرة السلك. على سبيل المثال ، مع الإبر الأسلاك والزجاج لمس ، يتم نقل الإبرة الزجاج لصرف الإبرة سلك مسافة 5 علامات على شبكاني كما يتضح من خلال القطع العين. تتحرك الإبرة الزجاج تنفصل جانبية الإبر. الإبرة السلك ثم يعود إلى وضعها الأصلي في البداية ، ولكن الإبرة الزجاج سيكون الآن في وضع جديد. ثم تحسب الحمل على الزجاج من الإبرة موقفها صفر القوة الجديدة ناقص موقف كل من الإبر في حمولة قوة متساوية (سواء الإبر وتصدت لها). في هذا المثال ، إذا كنت تهرب كل من الإبر للاحتفال 5 (من الصفر على شبكاني) ، والإبرة سلك عودة الى الصفر في حين أن GLAانها عازمة SS الإبرة قد تتبادر إلى 25 ، إذا كان الأمر كذلك ، 20 علامات مع القوة نفسها التي استعرضوا السلك إبرة 5 علامات. ولذلك ، فإن نسبة الانحناء بين القيمتين الإبر معايرة الإبرة والزجاج ، وأنها قاسية ¼ مثل إبرة السلك. لان الحسابات الربيع الدائم في القسم 3.4 استخدام نسب مسافات أنها مستقلة عن حجم التكبير أو شبكاني الانقسام. النظر الحد الوحيد هو أن الانحرافات صغيرة بما يكفي لتكون مرنة في المدى خطية من الإبر.
- لا سلسلة من الانحرافات في مواقف 5،10،15،3،7،12،17،5،10،15 علامات على شبكاني. إذا كان أي الانحرافات الافراج تكرار تلك الأوان. الانحرافات بين الحفاظ على الإبرة في محاذاة الأسلاك صفر. لكل من هذه الانحرافات ، لاحظ كمية نحيد والنهائية صفر تحميل موقف إبرة الزجاج بعد الافراج عنهم. وهذا يخلق 10 زوجا من نقاط البيانات. ويمكن استخدام سلاسل أخرى ، لكنها صممت هذه السلسلة لتعطي مؤشرات مبكرة من الاتساق الداخلي ، والتباطؤ الخطي (نتائج الانحرافات 5 + 10 = 15 ؛ 3 +7 = 10 ، والانحرافات 5،10،15 بعد الإفراج ينبغي تقريبا نفس الشيء في بداية ونهاية).
- الانحدار الخطي من الانحرافات المسجلة من القسم 3.3 يعطي تقدير أكثر دقة لثابت الثني من الإبرة الزجاج المتوسطة من نسبة انحراف واحد. كما يوفر تقييما للالخطي من الإبرة ونوعية المعايرة المشار إليها بواسطة قيمة أعلى r وقربه من اعتراض من خط الانحدار الى نقطة الصفر. لإعداد البيانات 10 زوجا من الباب 3.3 لالانحدار ، يتعين على العدد الثاني من أزواج المسجلة ، المباراة النهائية صفر تحميل موقف إبرة الزجاج بعد الإفراج عنهم ، لديهم انحراف المقابلة الأولي مطروح منه ، الذي هو العدد الأول من الزوج. مرة واحدة يتم تنفيذ هذه العملية مجموعة من أزواج الرقم الجديد يتكون من انحراف الأولي وتحسب الفرق المقابلة. إضافة أزواج السيطرة 5 من 0،0 إلى 10 أزواج هذه البيانات التجريبية لترسيخ الانحدار الخطي في صفر صفر قوة للانحراف. ليس هذا المطلوب تماما ، ولكنها تضيف درجة اضافية من الدقة. 0،0 في ترسيخ ويستند على مبدأ أن لا نية حقيقية لدى إبرة عندما لا يتم تطبيق القوة. مع هذه المعطيات أزواج 15 حساب الانحدار الخطي. ربيع الانحناء الدائم للزجاج إبرة يتم معايرة هو معروف الإبرة سلك ثابت الانحناء مقسوما على هذا الخط المنحدر من الانحدار.
4. معايرة الإبرة الزجاج العمل المستخدمة لمعالجة الخلايا العصبية
- ومعايرة الإبر الزجاج الامتثال كافية ، μdynes 15/02 / ميكرون ، لاستخدامها على الخلايا العصبية تجريبيا ضد الإبرة الزجاج المتوسطة بطريقة مشابهة كما هو موضح في القسم 3. وهذا هو ، الإبر مرشح العمل صرف إبرة المتوسطة من صلابة المعروفة وضعها في موضع الإبرة سلك في الباب 3. قد يكون الزجاج من الإبر أقل من 2 μdynes / ميكرون قصرت قليلا لجعلها مجموعة صلابة مناسبة.
5. هي سابقة التجهيز الإبر مع عوامل مرفق
- يتم ضغط الإبر في أن يعامل في جانب قطعة من الطين الذي عقد في المشبك المبينة أعلاه دورق 10 مل من محلول عامل المرفق ، بحيث يتم مغمورة سوى غيض من الإبرة في الحل. تخبط رمح أنبوب شعري غير مرغوب فيه لأنه يزيد من تراكم الطلاء على طرف مع مرور الوقت ، والذي يتغير صلابة ويقلل كفاءة الإبرة للمرفق. لا يمكن إلا أن إبرة معايرة أن تستخدم ما يقرب من 4 مرات ، ويمكن تعديلها للتأكد من دقتها. وانخفض الإبر بالتتابع في حل متعدد الليزين 0.1 ٪ لمدة 30 دقيقة ثم كونكانافالين A (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة. يمكن استخدام متعدد الليزين مرارا لعدة اسابيع ويتم تخزينها في -20 درجة مئوية. جعل كونا الأسبوعية الطازجة وتخزينها في 4 درجات مئوية. لأنواع الخلايا الأخرى قد قدمت إلى الجزيئات سطحها بواسطة الإبرة توجيه مسار التحقيق.
6. ضبط معدات تصل
- تم تعيين محطة عمل على سحب ما يصل اهتزاز الجدول العزلة. وهو يتألف من مجهر مقلوب مزودة شريط على طول الجهة اليسرى فوق خشبة المسرح وتضارب الهيدروليكية الملحقة بها ، وعقد تمديد عادتنا يوازن ، الذي يتم إدراج حامل أداة مزدوجة. موقف micromanipulator الهيدروليكية على طول الشريط ، عن طريق وضع إبرة على حامله في مسار المجهر للضوء ، في حين تتركز يتحكم تتلاعب في نطاقاتها. في الوقت الذي يعالج الإبرة مع عوامل المرفق ، بدوره على Ringcubator أو غيرها من نظام التدفئة المرحلة المجهر ، وبالتالي فإن المرحلة هي في التوازن الحراري في بداية التجارب.
7. محاذاة الإبر
- الهدف هو الحصول على الإبر اثنين (المرجع الإبرة والعمل) في حقل المجهر البصرية مرتبة بحيثنصائح هم حوالي 50 ميكرومتر إربا ، إربا ، مع الإشارة أعلاه الطبق الثقافة ، وبالتالي الخروج نوعا من التركيز عند سحب الإبرة في التركيز على طبق. هي التي شنت هذه الإبر اثنين في أصحاب الإبرة بهم إلى حامل مزدوج أداة لايكا ، والذي هو في حد ذاته micromanipulator الصغيرة. باستخدام المجهرية صاحب المزدوج الأداة ، يتم إحضارها نصائح اثنين الى محاذاة موازية. إدراج إشارة إلى الإبرة حامل الإبرة على بعد مسافة قصيرة ، وهو ما يكفي للسماح لتشديد طوق الخناق عليه ومكان هذا الاجتماع في الجانب الأيمن من صاحب أداة مزدوجة. إدراج معاملة العمل نصف طول الإبرة في ماسك الإبرة ووضعه في الجانب الأيسر من حامل أداة مزدوجة. عندما يتم إحضارها نصائح إبرة اثنين إلى الأمام نفس الموقف واصطف ، وأطوال مختلفة من الإبر في حامليها ارباك الياقات حتى لا تعرقل الحصول على نصائح قريبة جدا معا. تتم من خلال المقاطع 7.2 7.4 بدون تكبير. تتم المقاطع 7،5-7،8 تحت الملاحظة المجهرية.
- قبل تعيين micromanipulator الهيدروليكية بحيث تحكم العمودي هو كل الطريق صعودا. تعيين عناصر تحكم أخرى إلى مركز لنطاقها ، وكذلك إلى الأمام / المسمار الخلفي للحامل الأداة.
- جلب اثنين الإبر نصائح معا باستخدام برغي تعديل جنبا إلى جنب على الجانب الأيمن من صاحب الأداة. ثم دفع أصحاب الإبرة نفسها إلى الأمام أو الخلف في حامل أداة مزدوجة حسب الحاجة لتقديم نصائح الإبرة إلى الأمام لوضع نفسها. فحص الزوج من جهة واستخدام الجانب الأيمن أعلى / أسفل المسمار لجلب نصائح في نفس الطائرة. تدوير أصحاب الإبرة في حامل أداة لسد الفجوة إذا كان ابرة في زوايا حامل الإبرة والخمسين.
- أرجوحة حامل الأداة ومكان النصائح في مسار الضوء فوق سطح وسائل الإعلام ، الصيد عليهم بشدة. تشديد المسمار كرة مشتركة في القاعدة قبل نقل يدك بعيدا.
- العثور على نصائح إبرة الخاص في المجال المرئي المجهر قبل تقديمهم إلى أسفل بعيدا جدا ، والخروج منها أو كريهة لهم الحطام في قاع الطبق الثقافة. في صحن 60 ملم ، و 15 مل من المتوسط توفر عمق كاف لهامش من الأمان فوق قاع الطبق. هل ممارسة الأولية بإبرة uncalibrated للحصول على المظهر من هذه الخطوة. تبدأ بالتركيز التصاعدي فوق الخلايا في الجزء السفلي من الطبق مع الهدف a10x. القيام بذلك في مساحة الصحن بعيدا عن الخلايا ضوء التجارب الحساسة أو مثالية. انخفاض الإبر في وسائل الإعلام. تحريك الإبر الجانب الى الجانب يبحث عن ظلها. إذا كنت لا نراهم ، وانخفاض قليلا منهم ونقلهم إلى الأمام في الطبق ، كرر الجانب لتمرير الجانب. العثور على الحافة ، عن طريق تحريك الظهر (أو إلى الأمام) وهبوطا.
- بدوره المسمار جنبا إلى جنب لمعرفة أي إبرة كنت قد وجدت. إذا كان يتحرك مع المسمار كنت تبحث في الإبرة المرجع ، اذا لم انها ابرة معايرة. لمعايرة الإبرة ، إلى جانب استخدام المسمار الجانب لدفع الإبرة إشارة تجاهها. التحرك إلى الأمام والخلف يبحث عن الظل المرجعي. إذا كان هذا هو المرجعية إبرة كنت قد وجدت ، المسمار إلى اليسار في حين نقل هيدروليكية إلى اليمين يبحث عن إبرة في معايرة.
- عندما يقع كل من الإبر استخدام الضوابط الدقيقة للحامل أداة مزدوجة لخط لهم. زاوية حادة من الإبر المقبلة على حافة الطبق يتسبب في أعلى / أسفل إلى السيطرة لها أيضا إلى الأمام ، وإطالة مكون إلى تعديل بالزيادة وتقصير مع أسفل. في الجانب الأيسر ، وإلى الأمام / استعادة السيطرة المسمار والعكس ، ودفع تلميح إلى الأمام هو أيضا إلى أسفل الطبق ، وسحب إعادته تسحب الإبرة بينما رفع لموقف الطرف. لذا ، فإن رفع إشارة ودفع الإبرة معايرة إطالة لجعلها على حد سواء حتى على نصائح في حين يصل لهم أيضا في العلاقة المثلى من مرتفعات فوق الطبق. إذا كانت إبرة مرجعية تمتد إلى أبعد من عمل الإبرة يمكنك المسمار / دفع الإبرة أسفل العمل وإلى الأمام في حين يتأرجح الإشارة إلى أسفل وتقصير حتى اثنين ، بل هي والإبرة العمل هو أقل من ذلك. في بعض الأحيان مجموعة مسامير لن تأتي الإبر معا ، ولذا قد تحتاج إلى الشريحة بلطف أصحاب أنفسهم ، تأكد من إحكام جيدا الكرة اللولبية المشتركة ، واستخدام أصابعك مثبتة على حافة حامل أداة لاستخدام القوة لتمرير مهاوي. يمكنك أيضا تدوير أصحاب الإبرة في حامل الأداة كما حدث من قبل ، في حين تصل في وسائل الاعلام ومراقبة التنفيذ ، معرفة ما إذا كانوا قد أصبحوا أقرب معا.
- سجل صورة هذا الموقف المعدلة النهائية ، وفصل من الإبر دون أي تطبيق القوة هي المسافة مرجع صفر. رفع الإبر الطائرة فوق عينة و 'حديقة' لهم عند حافة الحقل البصري.
- قد تتم إزالة الحطام على إبرة من خلال رفع من خلال هلالة. أول تحرك الإبرة المرجعية بعيدا عن إبرة أخرى لتجنب نصائح two الإغلاق على بعضها البعض. قد يكون من الضروري يمر متعددة. </ OL>
- إلى هذه النقطة ، فقد لوحظ أن الإبر مباشرة من خلال المجهر. بداية مع مرفق الخلية ، سيتم ملاحظات سواء من خلال المجهر وعلى شاشة الفيديو. الجانب اليمين / اليسار على حد سواء غير متطابقة ، ولكن التوجه إلى أعلى / أسفل الصورة على شاشة الفيديو ليست هي نفس (الجاذبية) صعودا ونزولا على المجهر. لتوضيح الفوارق بين التوجهات أعلى / أسفل كما لوحظ مباشرة من خلال المجهر وكما لوحظ على شاشة الفيديو ، وسوف يحال هذا الأخير إلى أنه 'حتى' و 'أسفل ،' أي في الاقتباس
- تتم عملية السحب من خلال تغيير موقف الإبر اثنين من اليسار إلى اليمين ('الأفقية') على شاشة الفيديو. وبالتالي ، يتم اختيار محوار التجريبية في جزء منه على محور عصبي يمتد في نفس الاتجاه "أفقي". يمكن أن تنحرف محوار 'الهابط' من 'الأفقية' بنسبة تصل إلى 15 درجة مئوية ، كما سيتم تعويض هذه مناورة من قبل عن "رفع" من الفرع 8.5. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي للمحوار الذي تم اختياره ليكون التلاعب طول جسم الخلية أو أكثر ، مع مخروط النمو النشط. ويفضل المحاوير تمتد إلى حق خلايا الجسم نتيجة لمجموعة تتكون من حامل أداة مزدوجة مع الإبرة العمل التي شنت على يسار الإبرة المرجعية يوسع مثل هذا التوتر تطبيقها خلال السحب ، والفجوة بين الإبر اثنين.
- ويمكن سحبها ومحوار الوزراء الذي يمتد الى الجهة اليسرى من خلايا الجسم من دون إعادة توجيه صاحب المزدوج الأداة التي شكلتها اتساع الفجوة بين الإبر ورفع إشارة الإبرة قليلا. هذا يسمح للمزيد من مساحة القطر لإبرة المرن تجاه المرجعية ويمر تحته إذا لزم الأمر. سيتم سحب مقدما ثم إلى اليسار وسحب الإبرة سوف ينحني نحو الإبرة المرجعية كما يزيد من حدة التوتر. عند تحليل البيانات تم إدخال هذا التغيير في العلاقة بين التوتر على المسافة إشارة إلى جدول بطرح فصل إبرة قياس المسافة من صفر مرجع بدلا من مسافة الصفر من القياس.
- تحريك الإبر بالقرب من مخروط نمو محور عصبي ، سجل مسافة الصفر مرة أخرى ، ورفع الإبر ، والهواء حتى الاهتزاز الجدول العزلة.
- ربما مجرد وضع الإبرة التي تعمل في الجبهة لدفع عجلة النمو مخروط مرفق إنتاج عفوية مع تقدم مخروط النمو. المؤيدة للتلاعب بنشاط مرفق إلى مخروط النمو ، ووضع إبرة السحب أسفل 'تحت' مخروط النمو وانخفاض ثم الإبرة ضد أسفل الطبق. سيؤدي ذلك إلى صرف الإبرة 'حتى' ، والانحناء والانزلاق على طول الطبق في مخروط النمو ، وذلك بإزاحة ونقله "التصاعدي". اضغط على إبرة ضد قاع الطبق يكفي بحيث مخروط النمو السنانير حول الطرف الإبرة ، ولكن ليست بعيدة بحيث ينزلق أكثر من الإبرة والشرائح المتخلفة الانتظار 20 دقيقة للسماح للقبضة تصبح المنشأة. من ذوي الخبرة ، يمكن أن تكون نسبة النجاح عالية مثل 90 ٪ ، ولكن من عادة في حدود 75 ٪. في البداية قد تكون أقرب نسبة النجاح الى 25 ٪. في شرك الأساسي عند بداية هو "عبر التلاعب" مخروط النمو. التفاعل الأولي في "خطوة رفع' تستغرق بضع ثوان. ثم ينبغي أن مخروط النمو أن تترك وحدها لتشكيل شركة المرفق. ثم يجب توخي الصبر خلال الخطوات التالية.
- عندما مخروط النمو في الإبرة ، وضع التوتر الطفيف على ذلك عن طريق تحريك الإبر إلى اليمين ، ورفع الإبرة قليلا. تعويض عن الإبرة تتحرك "الهبوط" عن طريق تحريك الإبرة إلى الأمام قليلا في حين رفع. رفع على مراحل حتى يكون لديك عملية المرفقة عمودي يمتد من إبر وفوق سطح الطبق. ترتيب عمودي من محور عصبي يمتد من الإبر مطلوب مرة واحدة بدأت سحب قوة لقياسات دقيقة ، لذلك أي أن القوة الوحيدة ناقلات تطبيقه هو على طول محور محور عصبي. إذا كانت زوايا عملية سحبها بعيدا عن إبرة ، ولد متجه القوة على طول محور الإبرة بدلا من الانحناء والإبرة لا تقاس القوة الإجمالية. فرار من ركلة المرفق طبق الأولية يحسن آفاق مرفق دائم للإبرة. قد غيض يكون فوق سطح طبق (ينظر في الاهتزازات ضئيلة أو طائرة مختلفة من التركيز من صحن) أو لمسها مع الحد الأدنى من القوة. سحب الكثير جدا على السطح سوف تحرف القياسات. وهناك إبرة التمسك الطبق ، أو إلى عملية الخلايا reattaching الركيزة يؤدي إلى تحميل قوة إذا كنت تحاول أن تبقي على تحريكه ، ثم فجأة والتي 'انبثاق فضفاضة" مع احتمال فقدان المرفق. للافراج عن إبرة من هذه النقطة الشائكة أ ، تحرك الإبرة إلى الأمام والخلف ('حتى' و 'أسفل' في الطائرة من الشاشة) بدلا من إضافة المزيد من القوة (يمين).
- ويتم إنجاز القطر بتطبيق زيادات صغيرة للقوة من جانب تحريك الإبر بعيدا عن جسم الخلية. القوى الأرصادVED باعتبارها الفجوة المتزايدة بين الإبر. مع زيادة حدة التوتر تدريجيا ، ومراقبة بعناية عن أي دلائل على مفرزة للمخروط النمو من الإبرة.
- إذا كان يفصل مخروط النمو وعدم التراجع بسرعة ، وانخفاض حدة التوتر والانتظار قليلا ، وكثيرا ما مخروط النمو سوف "اللحاق بالركب" والاستيلاء على الحافة مرة أخرى. إذا كان محور عصبي يأتي قبالة الإبرة قبض عليه قبل أن تتراجع خلال محاصرة ضد الطبق مع الإبرة وتكرار "رفع" أو "هدم" لوضع التوتر قليلا على ذلك وانتظر حوالي 10 دقيقة للمرفق إعادة . بعد محاولتين فاشلتين ، ونحن نوصي باستخدام خلية مختلفة.
- المحافظة على مستوى وسائل الإعلام في الطبق بإضافة الماء كل ساعة لموازنة التبخر ، وذلك باستخدام علامة على جانب الطبق للدلالة على عمق الأولي. مع ماصة باستير طويلة ، إضافة الماء ببطء على جانب الطبق بعيدا عن الإبر. تمديد عملية في كثير من الأحيان "الاكشاك" إذا كانت وسائل الإعلام يصبح مفرط التناضح. ومن الممكن أن تضعف التبخر مع الطلاء النفط على سطح وسائل الإعلام ، ولكن هذا يجب أن يكون إضافتها بعد الإبرة في وسائل الإعلام. إذا كانت الإبرة يمر النفط ، ومخروط النمو هو أقل بكثير من المحتمل أن نعلق على الإبرة.
- في نهاية التجربة ، قبل رفع الإبر من إعادة فحص ، صحن المسافة صفر.
- قراءة المواقف من الإبر على طول المحور الأفقي على الشاشة ، والموقف من خلايا الجسم وأوقات قياسية. المسافة من الجسم ناقص من الإبر المسافة تفريغ صفر مضروبا ثابت الانحناء للإبرة يساوي μdynes القوة التي يجري تطبيقها. معايرة المسافات الصورة المعروضة على الشاشة باستخدام ميكرومتر المرحلة.
- مهم جدا لضمان جودة البيانات والمسافة المرجعية (صفر القوة) الفصل بين الإبر لا يتغير أثناء التجربة. تغيرات حرارية سوف تؤثر على المعدات على نطاق ميكرون ، أي لا بدوره على تكييف الهواء أثناء التجربة. أيضا إذا كان النظام الخاص التدفئة المجهر لديه الوقت تأخر الانتظار حتى يكون لديك الاستقرار الحراري. وRingcubator يقلل من الوقت الضائع ويعزل أيضا التغييرات الحرارية في طبق من بقية المجهر وتلاعب النظام الحراري لتقليل الانجراف الصفر والتغيرات في التركيز. قوة أخرى تغيير فصل الإبرة هو تفريغ التوتر السطحي على اعمدة الإبرة. تحميل التغييرات مع عمق السائل في الطبق. التحقق من مسافة إشارة النسخ الاحتياطي الإبر ورؤية مؤقتا مسافة لا قوة الصفر أحيانا أثناء تجربة تحسين نوعية البيانات ، وحتى لو كنت تلاحظ تغييرا في الانفصال.
8. ربط إلى الخلايا
9. تمديد عملية المحوار أو خلية
10. تحليل البيانات
11. ممثل النتائج :
قوة معايرة يمكن بسهولة الإبر والزجاج يمكن تطبيقها على أي منطقة الخلوية ، وعادة ما مخروط النمو ، كما تصور مباشرة بواسطة المجهر الضوئي. مع العلاج المناسب من الإبرة للحصول على مرفق الخلوية ، يمكن تطبيقها تجريبيا الميكانيكية التوتر في المنطقة الخلوية في المصالح ، أو يمكن أن تقاس القوات التي تنتجها تلك المنطقة. ويرد ممثل التجربة القطر العصبية في الشكل 1 ، حيث تم مضاعفة طول محور عصبي سحبها في خلال ساعتين.
الشكل 1. اختيار الدجاج والظهرية تربيتها الجذر خلية العقدة مع التوجه المفضل للسحب. يتم تسجيل الأولي المسافة بين مرجعية صفر الإبر قبل يبدأ التلاعب التجريبية (A). يتم تطبيق مناورة 'رفع' لمخروط النمو (B). قطر تبدأ التحميل زيادة القوة كما يدل على ذلك الفصل من الإبر (C). تقطر مددت المحور ، يسرت التحالفات "الأفقية" وعمودي من محور عصبي سحب الإبرة والقياسات قوة العمل الجيدة (D). بار = 40 ميكرومتر. معايرة الإبرة = 6.9 μdyne / ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات لتطبيق وقياس قوات الخلوية لديها تاريخ طويل 9. كان الدافع أصلا لدينا وسيلة لعمل براي دينيس ، الذين استخدموا الإبر والزجاج مماثلة لبلدنا أن الخلايا العصبية 'جر' بمعدل ثابت باستخدام جهاز آلية هيدروليكية 10. هناك العديد من وسائل بديلة لتطبيق قوى للخلايا والتي تشمل : السائر المحركات 11 ، 12 حبات المغناطيسي ، الأشعة microfabricated 13 و 14 تدفق السوائل. هذه الأخيرة هي مماثلة لنهجنا في هذا هو في نهاية المطاف تحقيق معايرة الخلوية ضد الانحناء شعاع من صلابة المعروفة والقياسات الخلوية يتوقف على الملاحظات المجهرية الضوئية. بالمقارنة مع المناهج الأخرى ، فإن الميزة الأساسية لأسلوبنا 3 هو القدرة على تطبيق في وقت واحد وقياس القوى في نطاق μdyne باستخدام المعدات (المجاهر وmicromanipulators) النموذجية للإدارات علوم الحياة.
باستخدام هذه الأساليب ، التي تمارسها قوات المخاريط نمو الخلايا العصبية لأنها مسبقا وقد تم قياس 15. وقد تم تحديد العلاقة الميكانيكية معدل استطالة محواري ردا على التوتر اتباع نيوتن السوائل مثل التحفيز على الاستجابة العلاقة 7. وقد أظهرت حساسية النسبية للمحاور ردا على التوتر لتكون أكبر لمن الخلايا العصبية في الدماغ المركزي عن خلايا عصبية طرفية من الجنين الدجاج 2. تراجع من المحاور كما تم التحقيق فيها 7. يمكن أن الخلايا العصبية مع عدم وجود تحديد المحاور والاستقطاب التي محواري / شجيري التي تسيطر عليها تطبيق التوتر الميكانيكية 5. معربا عن الخلايا الليفية في GFP المسمى الأكتين أو تويولين ، ونحن تصور مباشرة استجابة الهيكل الخلوي للحجز بسيطة من الإبرة وكذلك ردها على التغييرات من التوتر 8. وقد مرفقات الخلية إلى بعضها البعض أو ركائز اختبار 1. ويمكن دراسة القوى الدافعة للخلايا متحركة ويمكن قياس جاذبية filipodia اقتراب 16. وقد استخدمت الاقتراحات المعروضة بواسطة الميتوكوندريا المسمى ضمن المحاور مقطورة لنقل المواد نموذج الداخلية (انخفاض سرعة النقل) وتحديد الخلايا العصبية التي ينمو بنسبة بالإضافة الشامل مقحم على طول العمود محواري 6،17.
للمحققين ببساطة المهتمة في تطبيق القوات دون قياس عليها ، لا يتطلب استخدام الإبرة مرجع 18. في المقابل ، إذا المطلوب قياسات القوة الإبرة مرجع أساسي لتوليد بيانات دقيقة. عموما ، نحن تقدير الخطأ في القياسات القوة المطلقة ليكون في حدود 5 ٪ إلى 10 ٪ مع أكبر مصدر للخطأ الناشئة في عملية قراءة البيانات. الصعوبة تكمن في تحديد على وجه الدقة مكان الإبرة المرجعية امتبائر والتقليل من آثار يعود الحركات الصغيرة وإيابا (الاهتزازات) من الإبر. إبرة دون إشارة ، فإن هذه المصادر من الخطأ أن يكون أكبر من ذلك.
لا حاجة التلاعب التجريبية مع نهاية الدورة القطر. يمكن تركيبها مخاريط النمو سحبها إلى الخلايا الأخرى أو تثبيتها في صحن 5. باستخدام هذه الفرصة يمكن التلاعب عمدا العصبية الدقيقة circutry يتم تكوينه ، مما يسمح للنقاش عبر أنواع مختلفة من الخلايا التي سيجري بحثها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان بالمساهمات الهامة للE. الدكتور روبرت Buxbaum في تطوير هذه المنهجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
