Summary
2-1000 microdyne रेंज में न्यूरॉन्स पर बलों के अनुप्रयोग और प्रत्यक्ष मापन उच्च परिशुद्धता के साथ कैलिब्रेटेड गिलास सुई का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. इस पद्धति को नियंत्रित करने के लिए और axonal विकास के axonal दीक्षा, axonal तनाव, axonal बढ़ाव के वेग, और बल वैक्टर सहित कई पहलुओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
सेल neuronal axons की जोड़तोड़ और विस्तार कैलिब्रेटेड 10-1000 μdyne रेंज 1,2 में सेना को मापने और आवेदन करने में सक्षम सूक्ष्म फाइबर ग्लास के साथ पूरा किया जा सकता है. सेना माप गिलास सुई, जो एक सीधा और अनुभवजन्य 3 विधि द्वारा calibrated हैं झुकने Hookean के अवलोकन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. Fabricating, औजार, इलाज, और कोशिकाओं पर सुइयों का उपयोग करने के लिए उपकरण आवश्यकताओं और प्रक्रियाओं को पूरी तरह से वर्णित हैं. बल पहले से इस्तेमाल किया और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं जो इन तकनीकों को लागू किया गया है पद्धति के लचीलेपन का प्रदर्शन कर रहे हैं और भविष्य जांच 4-6 के लिए उदाहरण के रूप में दिया शासनों. तकनीकी फायदे जोड़तोड़ द्वारा उत्पादित बलों की निरंतर 'दृश्य' और सीधे सेलुलर घटनाओं की एक किस्म में हस्तक्षेप करने की क्षमता हैं. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेना की टुकड़ी और सुसंस्कृत 8 सेल के किसी भी प्रकार पर यांत्रिक मापन; ये प्रत्यक्ष उत्तेजना और axonal विकास और 7 तर्क के विनियमन शामिल है .
Protocol
1. कांच सुइयों बनाना.
- एक समायोज्य सूक्ष्म सुई खींचने लंबाई में 4 मिमी और है कि ठोस बीम बंद हो जाती हैं के बारे में एक पतला टिप के साथ सुई बनाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. के रूप में एक लंबी लचीला टिप करने के लिए विरोध किया, इस छोटे से 4 मिमी की लंबाई में प्रयोगों के दौरान सुई की नोक के कंपन सीमा. 4 मिमी फाइबर के समीपस्थ क्षेत्र में, सुई गिलास 1 मिमी के भीतर 15 सुक्ष्ममापी टयूबिंग के व्यास से तेजी से tapers, जबकि बाहर का सबसे फाइबर के 1 मिमी व्यास में 2.5 सुक्ष्ममापी है. हम R-6 गिलास केशिका ट्यूब, आयुध डिपो 0.9 मिमी, आईडी 0.6 मिमी 8 "लंबाई और एक BB-CH पेचकश का उपयोग करें. यदि अन्वेषक अलग वसंत गुणों के साथ (यानी एक अलग लंबाई और या अन्य बल पर्वतमाला, सुइयों को मापने में दिलचस्पी है मोटाई). खींच होना चाहिए प्रत्येक केशिका ट्यूब चार 2 "सुई में खींचती है. सुई दो क्ले मॉडलिंग 'सांप' जो सुइयों हल्के से दबाया जाता है के साथ 160 मिमी पेट्री डिश को कवर में संग्रहीत हैं.
- कांच सुई, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक तार में वर्णित किया जा सुई, अनिवार्य रूप से बल के वांछित माप के लिए उपयुक्त कठोरता के झुकने स्प्रिंग्स के रूप में इस्तेमाल किया मुस्कराते हुए हैं. ध्यान दें कि इसकी लंबाई के घन के रूप में एक किरण तराजू के झुकने बल, संरचना की परवाह किए बिना. इस प्रकार, किसी के लिए अंशांकन नीचे वर्णित चरणों का, अपर्याप्त कठोरता के एक सुई / बीम छोटा (उदाहरण के लिए एक 10% छोटा कठोरता में एक 28% की वृद्धि, 0.9 3 यानी उत्पादन) की एक छोटी राशि के द्वारा stiffer किया जा सकता है.
2. बनाना और एक तार सुई औजार
- एक गिलास सुई के अंदर (1.1 अनुभाग में किए गए) के माध्यम से एक .001 "Chromel तार डालने के साथ अपने टिप टूट द्वारा एक तार अंशांकन सुई बनाओ. तार खींचो बाहर टिप की लंबाई 26 मिमी और यह गोंद के साथ जगह में सुपर गोंद एक हुक में तार के बाहर 1 मिमी झुको.
- बनाओ वजन सूक्ष्म .003 "Constantan तार के 1 मीटर से तार, यह एक मीटर छड़ी के लिए टेप के रूप में यह सीधे संभव प्राप्त करने में सहायता करने को मापने के तार के 1 मीटर वजन, सही यह 1 सेमी टुकड़े काट, और मोड़ कई टुकड़ों में बनाम
- तार सुई calibrating एक मापने लजीला व्यक्ति और एक micromanipulator के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है. खुर्दबीन एक सार्वभौमिक बूम स्टैंड, ऐसी है कि तार सुई के नीचे विक्षेपन मनाया जा सकता है है का उपयोग कर अपने पक्ष पर 90 ° झुका हुआ है. एक ऐसी है कि कांटे की शकल क्षेत्र खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष को सीधा micromanipulator पर एक उपकरण धारक में 2.1 अनुभाग के तार सुई पर्वत. एक लजीला व्यक्ति निशान के साथ रेखा तार सुई के हुक. हुक पर 1 सेमी वजन सूक्ष्म रुको और विक्षेपन रिकॉर्ड. मनाया विक्षेपन (सुक्ष्ममापी) द्वारा विभाजित: संदर्भ तार के झुकने निरंतर (μdynes सुक्ष्ममापी /) माइक्रो वजन के अनुपात (1 मिलीग्राम = 0.98 dynes नोट) के रूप में गणना की है. अगले कदम के लिए तार सुई तैयार करने के लिए, एक स्केलपेल के साथ हुक बिंदु वजन पर कटौती. हुक की उपस्थिति अतिरिक्त भार है कि झुकता है एक छोटे से डिग्री करने के लिए तार. इस प्रकार यह लजीला व्यक्ति में तार की प्रारंभिक स्थिति प्रभाव से पहले वजन जोड़ा है. तार वसंत निरंतर का माप तार विक्षेपन से निकाली गई है जब वजन मोड़ बिंदु (तार के भविष्य टिप) जोड़ा जाता है. जब हुक काट रहा है यह वसंत तार की निरंतर परिवर्तन नहीं करता है.
3. मध्यवर्ती गिलास सुई calibrating
- मध्यवर्ती कांच सुइयों के अंशांकन एक आंख लजीला व्यक्ति के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग की आवश्यकता है. खुर्दबीन मंच के एक तरफ एक यांत्रिक micromanipulator ऑप्टिकल क्षेत्र के केंद्र में धारा 2 के तार सुई पकड़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है. दूसरी तरफ एक तीन अक्ष हाइड्रोलिक (उपकरण तालिका देखें) micromanipulator मध्यवर्ती गिलास सुई कैलिब्रेटेड जा रहा है चाल के लिए इस्तेमाल किया है. Micromanipulators का प्रयोग, दोनों सुइयों के साथ एक ~ एक 160 मिमी में 45 ° x एक 10x क्षेत्र में 30 मिमी पानी की पेट्री डिश कोण ऑप्टिकल क्षेत्र के केंद्र में लाना.
- विंदुक खींचने पर विभिन्न सेटिंग्स के साथ खींच सुइयों के एक श्रृंखला के पहले मूल्यांकन के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. लक्ष्य के लिए एक झुकने 20-30 μdynes / सुक्ष्ममापी की लगातार वसंत के साथ एक मध्यवर्ती गिलास सुई बनाना है. मध्यवर्ती सुई के विक्षेपन के अनुपात को मापने के रूप में तार सुई के विक्षेपन की तुलना में कठोरता का निर्धारण किया जाता है. उदाहरण के लिए, तार और गिलास सुइयों को छूने के साथ, कांच सुई तार सुई लजीला व्यक्ति पर 5 अंक की दूरी आंख टुकड़ों के माध्यम से देखा के रूप में मोड़ना ले जाया जाता है. गिलास सुई बढ़ते बग़ल सुइयों disengages. तार सुई तो अपने मूल शुरू करने की स्थिति देता है, लेकिन गिलास सुई अब एक नई स्थिति में हो जाएगा. गिलास सुई पर लोड तो इसके बराबर बल लोड (दोनों सुइयों लगे) पर दोनों सुइयों की स्थिति शून्य नई स्थिति शून्य बल से गणना की है. इस उदाहरण में, यदि दोनों सुइयों के लिए 5 (से लजीला व्यक्ति पर शून्य) निशान विक्षेपित हैं, तार सुई शून्य पर लौट जाएगा जबकि glaएस एस सुई 25 वसंत, यदि ऐसा है तो हो सकता है, यह एक ही शक्ति है कि तार सुई के निशान 5 flexed के साथ 20 अंक मुड़े. इसलिए, दो सुइयों के बीच झुकने के अनुपात गिलास सुई के अंशांकन देता है और यह ¼ तार सुई के रूप में कड़ी है. क्योंकि 3.4 अनुभाग में वसंत लगातार गणना दूरी वे बढ़ाई या लजीला व्यक्ति विभाजन आकार के स्वतंत्र हैं के अनुपात का उपयोग. केवल सीमित विचार है कि deflections सुइयों के रैखिक लोचदार रेंज में काफी छोटे हैं.
- लजीला व्यक्ति पर 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 निशान के पदों पर deflections की एक श्रृंखला करो. यदि कोई deflections रिहाई समय से पहले उन दोहराने. Deflections के बीच तार शून्य पर गठबंधन सुई रखो. इन deflections के प्रत्येक के लिए सीधे रास्ते से फिर राशि और अंतिम रिलीज के बाद गिलास सुई की स्थिति शून्य लोड ध्यान दें. यह डेटा बिंदुओं के 10 जोड़े बनाता है. अन्य दृश्यों, इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस श्रृंखला के लिए आंतरिक स्थिरता, linearity और हिस्टैरिसीस (5 deflections के परिणाम 10 + = 15 के प्रारंभिक संकेत देने के लिए डिजाइन किया गया था, 3 7 = 10; 5,10,15 deflections रिहाई के बाद किया जाना चाहिए लगभग शुरुआत और अंत) में एक ही.
- 3.3 अनुभाग से दर्ज deflections के रेखीय प्रतिगमन एक एकल विक्षेपन अनुपात की तुलना में एक मध्यवर्ती गिलास सुई के झुकने निरंतर के और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव देता है. यह भी एक उच्च r और शून्य करने के लिए प्रतिगमन लाइन के अवरोधन के मूल्य निकटता से संकेत अंशांकन की सुई और गुणवत्ता के linearity के एक आकलन प्रदान करता है. 3.3 अनुभाग से प्रतिगमन 10 के लिए डेटा जोड़े तैयार दर्ज जोड़े की दूसरी संख्या, अंतिम रिलीज के बाद गिलास सुई की स्थिति शून्य लोड, इसी प्रारंभिक से subtracted विक्षेपन है, जो की पहली संख्या है होना चाहिए जोड़ी. एक बार इस आपरेशन नया नंबर जोड़े का सेट प्रारंभिक विक्षेपन मिलकर प्रदर्शन किया है और इसी अंतर की गणना. 0,0 के इन 10 प्रयोगात्मक डेटा जोड़े 5 नियंत्रण जोड़े जोड़ें शून्य विक्षेपन के लिए शून्य बल पर रेखीय प्रतिगमन लंगर. यह बिल्कुल आवश्यक नहीं है लेकिन सटीकता की एक अतिरिक्त डिग्री कहते हैं. 0,0 पर एंकरिंग जब बल नहीं लागू किया जाता है कि सुई नहीं तुला हुआ है सिद्धांत पर आधारित है. इन 15 डेटा जोड़े के साथ एक रेखीय प्रतिगमन की गणना. गिलास सुई कैलिब्रेटेड जा रहा है के लगातार झुकने वसंत तार सुई जाना जाता है झुकने लगातार इस प्रतिगमन लाइन की ढलान से विभाजित है.
4. काम कर रहा गिलास सुई calibrating न्यूरॉन्स हेरफेर किया
- पर्याप्त अनुपालन के ग्लास सुई, 2-15 μdynes / सुक्ष्ममापी, प्रयोगात्मक न्यूरॉन्स पर इस्तेमाल किया जा मध्यवर्ती गिलास सुई के खिलाफ एक अनुरूप तरीके से कैलिब्रेटेड धारा 3 में वर्णित के रूप में कर रहे हैं. यही है, उम्मीदवार काम कर सुइयों ज्ञात तार सुई की स्थिति में रखा धारा 3 में कठोरता के एक मध्यवर्ती सुई मोड़ना. कम से कम 2 μdynes / सुक्ष्ममापी के ग्लास सुइयों उन्हें उचित कठोरता रेंज में लाने के लिए थोड़ा छोटा हो सकता है.
5. सुई अनुलग्नक कारकों के साथ pretreated हैं
- इलाज किया जा सुई लगाव कारक समाधान, ऐसी है कि केवल सुई की नोक के समाधान में डूब जाता है की एक 10 मिलीलीटर बीकर ऊपर सेट दबाना में आयोजित मिट्टी की एक गांठ के पक्ष में दबा रहे हैं. केशिका ट्यूब शाफ्ट Immersing अवांछनीय है क्योंकि यह समय है, जो कठोरता परिवर्तन और लगाव की सुई प्रभावकारिता कम पर टिप पर कोटिंग का संचय बढ़ता है. केवल एक कैलिब्रेटेड सुई लगभग 4 बार इस्तेमाल किया जा सकता है हो सकता है और सटीकता के लिए recalibrated किया जा सकता है है. सुइयों को क्रमिक रूप से 30 और फिर 30 मिनट के लिए मिनट concanavalin एक (1 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर) के लिए 0.1% polylysine समाधान में डूबा हुआ हैं. polylysine कई हफ्तों के लिए बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 4 में conA ताजा साप्ताहिक और दुकान डिग्री सेल्सियस अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए उनकी सतह सुई द्वारा प्रस्तुत अणुओं जांच के दौरान प्रत्यक्ष कर सकते हैं.
6. उपकरण सेट
- रस्से का काम स्टेशन एक कंपन अलगाव की मेज पर सेट कर दिया जाता है. यह चरण ऊपर छोड़ दिया और एक हाइड्रोलिक से जुड़ी जोड़तोड़, हमारे counterbalanced कस्टम एक्सटेंशन पकड़े, जो डबल उपकरण धारक डाला जाता है के साथ एक बार के साथ एक औंधा फिट खुर्दबीन के होते हैं. , स्थिति पट्टी के साथ हाइड्रोलिक micromanipulator खुर्दबीन प्रकाश पथ में अपने धारक में एक सुई डाल जबकि जोड़तोड़ नियंत्रण अपने पर्वतमाला में केंद्रित कर रहे हैं. समय सुई अनुलग्नक कारकों के साथ इलाज किया जा रहा है, Ringcubator या अन्य खुर्दबीन मंच हीटिंग सिस्टम पर बारी, तो चरण प्रयोगों की शुरुआत में थर्मल संतुलन में है.
7. सुई Aligning
- उद्देश्य खुर्दबीन के दृश्य क्षेत्र में दो सुइयों (संदर्भ और काम कर सुई) को मिल रहा है की व्यवस्था की ताकिउनके सुझावों के बारे में 50 सुक्ष्ममापी अलग कर रहे हैं, के अलावा, संस्कृति पकवान ऊपर संदर्भ के साथ, ध्यान इसलिए कुछ हद तक बाहर जब रस्से सुई पकवान पर ध्यान केंद्रित करने में है. उनके सुई धारकों में दो सुई एक Leica धारक डबल उपकरण है, जो अपने आप में एक छोटे micromanipulator है में बढ़ रहे हैं. डबल उपकरण धारक के micromanipulation का प्रयोग, दो युक्तियाँ समानांतर संरेखण में लाया जाता है. एक सुई धारक में संदर्भ सुई केवल एक कम दूरी सम्मिलित करने के लिए पर्याप्त कस कॉलर पकड़ के लिए और डबल उपकरण धारक के सही पक्ष में इस विधानसभा जगह की अनुमति है. सुई धारक में इलाज काम कर सुई अपनी आधी लंबाई डालें और डबल उपकरण धारक के बाईं ओर में यह जगह. जब दो सुई सुझावों ही आगे की स्थिति के लिए लाया जाता है और लाइन में खड़ा है, उनके धारकों में सुइयों के विभिन्न लंबाई कॉलर डगमगाते तो वे सुझावों बहुत करीब एक साथ हो रही बाधित नहीं है. 7.4 के माध्यम से 7.2 धारा बढ़ाई के बिना कर रहे हैं. 7.5-7.8 धारा सूक्ष्म अवलोकन के तहत किया जाता है.
- हाइड्रोलिक micromanipulator पूर्व निर्धारित तो ऊर्ध्वाधर नियंत्रण के सभी तरह है. अपनी सीमा के केंद्र के लिए अन्य नियंत्रणों के सेट, और भी आगे / उपकरण धारक के वापस पेंच.
- उपकरण धारक के दाईं ओर की ओर से पक्ष को एडजस्ट करने पेंच का उपयोग करके दो सुइयों सुझावों को एक साथ ले आओ. तब सुई धारकों को खुद आगे या पीछे डबल उपकरण धारक के रूप में ही आगे की स्थिति के लिए सुई सुझावों लाने की जरूरत धक्का. की ओर से जोड़ी की जांच करने और सही पक्ष का उपयोग करें ऊपर / नीचे एक ही विमान में सुझावों को लाने के पेंच. घुमाएँ उपकरण धारक में सुई धारकों अगर इसकी सुई धारक में एक सुई कोण अंतर को बंद.
- उपकरण धारक घुमाओ और मीडिया की सतह से ऊपर प्रकाश पथ में सुझावों जगह है, उन्हें तेजी से नीचे angling. आधार पर गेंद संयुक्त पेंच कस इससे पहले कि आप अपने हाथ दूर हटो.
- खुर्दबीन के दृश्य क्षेत्र में अपने सुई सुझावों का पता लगाएं इससे पहले कि आप उन्हें बहुत दूर नीचे लाने के लिए और उन्हें तोड़ने या उन्हें संस्कृति डिश के तल पर मलबे के साथ बेईमानी है. एक 60 मिमी पकवान में, मध्यम के 15 मिलीलीटर पकवान नीचे से ऊपर सुरक्षा के एक मार्जिन के लिए पर्याप्त गहराई प्रदान करता है. एक uncalibrated सुई के साथ एक प्रारंभिक अभ्यास क्या इस कदम के महसूस पाने के लिए. A10x उद्देश्य के साथ डिश के तल पर कक्षों के ऊपर ऊपर की ओर ध्यान केंद्रित द्वारा शुरू करो. प्रकाश के प्रति संवेदनशील या अनुकरणीय प्रयोगात्मक कोशिकाओं से दूर डिश के एक क्षेत्र में यह मत करो. मीडिया में सुई लोअर. की ओर से सुइयों की ओर ले जाएँ अपनी छाया के लिए देख रहे हैं. यदि आप उन्हें देख नहीं है, उन्हें एक छोटे से कम है और उन्हें पकवान में आगे बढ़ने, ओर पारित करने के लिए पक्ष दोहराने. टिप वापस जाने (या आगे) और नीचे का पता लगाएं.
- मुड़ें पक्ष की ओर पेंच देखने के लिए जो आप सुई पाया है. यदि यह पेंच संदर्भ सुई को देख रहे हैं के साथ चलता है, अगर यह नहीं करता है कैलिब्रेटेड सुई है. कैलिब्रेटेड सुई के लिए, पेंच पक्ष की ओर का उपयोग करने के लिए इसे संदर्भ सुई की ओर धक्का. इसे आगे ले जाएँ और वापस संदर्भ छाया की तलाश में. यदि यह संदर्भ सुई तुम पाया है, यह बाईं करने के लिए पेंच जबकि कैलिब्रेटेड सुई के लिए देख रहे हैं सही करने के लिए हाइड्रोलिक चलती.
- जब दोनों सुइयों स्थित हैं डबल उपकरण धारक के ठीक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए उन्हें लाइन. पकवान के किनारे पर आ रही सुइयों के खड़ी कोण ऊपर / नीचे नियंत्रण का कारण बनता है के लिए भी आगे है, ऊपर और नीचे के साथ एक छोटा समायोजन करने के लिए घटक लंबी है. बाईं ओर, आगे / वापस पेंच नियंत्रण विपरीत है, टिप आगे भी नीचे डिश में है धक्का, इसे वापस खींच वापस ले लेती है सुई, जबकि टिप स्थिति को ऊपर उठाने. इसलिए, संदर्भ को ऊपर उठाने और आगे कैलिब्रेटेड सुई धक्का दोनों को लंबा करने के लिए उन्हें सुझावों पर भी बना जबकि भी उन्हें पकवान ऊपर हाइट्स के इष्टतम संबंध में ला. यदि संदर्भ सुई काम कर सुई दूर से परे फैली हुई तुम पेंच / काम कर सुई नीचे और आगे धक्का कर सकते हैं जबकि संदर्भ झूल नीचे और यह छोटा है जब तक दो भी हैं और काम कर सुई कम है. कई बार शिकंजा रेंज सुइयों के साथ नहीं लाएगा, तो आप करने के लिए धीरे धारकों खुद को स्लाइड की जरूरत है, सुनिश्चित करें कि गेंद संयुक्त पेंच में अच्छी तरह से कड़ा है हो सकता है और का उपयोग करने के लिए अपने उपकरण धारक के किनारे के खिलाफ अंकित करने के लिए मजबूर लागू उंगलियों स्लाइड शाफ्ट. तुम भी उपकरण धारक में सुई धारकों को घुमाएगी सकता है पहले के रूप में, जबकि मीडिया में और प्रभाव देख, देख अगर वे करीब एक साथ हो रही है.
- इस अंतिम समायोजित स्थिति की छवि रिकॉर्ड, सुइयों के बिना किसी भी बल लागू की जुदाई शून्य संदर्भ की दूरी है. सुइयों नमूना और दृश्य क्षेत्र के किनारे पर 'पार्क' उन्हें विमान से ऊपर उठाएँ.
- यह meniscus के माध्यम से ऊपर उठाने के द्वारा एक सुई पर मलबा हटाया जा सकता है है. पहले संदर्भ सुई अन्य सुई से दूर स्थानांतरित करने के लिए एक दूसरे पर दो latching सुझावों से बचने. एकाधिक गुजरता आवश्यक हो सकता है. </ Ol>
- इस बिंदु करने के लिए, सुइयों माइक्रोस्कोप के माध्यम से किया गया है सीधे मनाया. सेल अनुलग्नक के साथ शुरू, टिप्पणियों दोनों माइक्रोस्कोप के माध्यम से और वीडियो स्क्रीन पर किया जाएगा. दोनों के बाईं / सही पहलू समान है, लेकिन वीडियो स्क्रीन पर छवि के ऊपर / नीचे उन्मुखीकरण के रूप में एक ही (गुरुत्वाकर्षण) ऊपर और नीचे खुर्दबीन पर नहीं है. ऊपर / नीचे दिशाओं के रूप में माइक्रोस्कोप के माध्यम से सीधे मनाया और के रूप में वीडियो स्क्रीन पर देखा के बीच अंतर स्पष्ट करने के लिए, बाद के रूप में 'ऊपर' और उद्धरण में नीचे, यानी करने के लिए भेजा जाएगा
- रस्से की प्रक्रिया वीडियो स्क्रीन पर दो बाएँ से दाएँ (क्षैतिज) के लिए सुई की स्थिति बदलने के द्वारा किया जाता है. नतीजतन, प्रयोगात्मक अक्षतंतु की पसंद हिस्से में एक ही 'क्षैतिज दिशा में विस्तार अक्षतंतु पर किया जाता है. अक्षतंतु के रूप में ज्यादा के रूप में 15 डिग्री से 'नीचे' 'क्षैतिज से, विचलित कर सकते हैं के रूप में यह 8.5 अनुभाग के' पुश 'पैंतरेबाज़ी द्वारा लिए मुआवजा दिया जाएगा. इसके अलावा, हेरफेर के लिए चुना अक्षतंतु एक सेल शरीर की लंबाई या अधिक एक सक्रिय विकास शंकु के साथ होना चाहिए. सेल शरीर के दाईं ओर का विस्तार axons कारण काम कर रहे संदर्भ सुई की बाईं करने के लिए मुहिम शुरू की सुई के साथ डबल उपकरण धारक के सेट, रस्से के दौरान ऐसी है कि लागू तनाव दो सुइयों के बीच की खाई चौड़ी करने के लिए पसंद कर रहे हैं.
- एक प्रधानमंत्री अक्षतंतु है जो सेल शरीर के बाईं ओर फैली डबल उपकरण सुइयों के बीच की खाई को चौड़ा करने और संदर्भ सुई एक थोड़ा ऊपर उठाने के द्वारा सेट धारक reorienting के बिना लाया जा सकता है. यह रस्सा सुई अधिक अंतरिक्ष संदर्भ की ओर फ्लेक्स करने के लिए और इसे नीचे से गुजरती हैं यदि आवश्यक अनुमति देता है. रस्सा तो छोड़ दिया करने के लिए अग्रिम जाएगा और रस्सा सुई तनाव बढ़ जाती है के रूप में संदर्भ सुई की ओर झुकना होगा. जब डेटा का विश्लेषण संदर्भ की दूरी के लिए तनाव के संबंध में इस बदलाव शून्य संदर्भ के बजाय माप से शून्य दूरी दूरी से सुई जुदाई माप subtracting द्वारा स्प्रेडशीट में दर्ज किया गया है.
- अक्षतंतु के विकास शंकु के लिए करीब सुइयों ले जाएँ, फिर से शून्य दूरी रिकॉर्ड, सुइयों बढ़ा, और कंपन अलगाव तालिका के ऊपर हवा.
- बस एक अग्रिम विकास शंकु के सामने में काम कर सुई लगा विकास शंकु अग्रिम के रूप में सहज लगाव का उत्पादन हो सकता है. समर्थक सक्रिय विकास शंकु के लिए एक अनुलग्नक में हेरफेर करने के लिए, रस्सा सुई जगह 'नीचे' विकास शंकु नीचे और फिर सुई पकवान नीचे के खिलाफ कम. यह सुई से ध्यान हटाने के लिए '' है, झुकने और साथ विकास शंकु में फिसलने पकवान, यह dislodging और यह बढ़ 'ऊपर की ओर' के लिए कारण होगा. पकवान नीचे के खिलाफ सुई बस पर्याप्त इतना है कि विकास शंकु सुई टिप के आसपास हुक प्रेस, लेकिन अब तक नहीं है कि यह सुई और पिछड़े स्लाइड्स पर स्लिप्स. 20 मिनट रुको करने के लिए एक पकड़ स्थापित हो. अनुभव के साथ, सफलता की दर के रूप में 90% के रूप में उच्च के रूप में हो, लेकिन 75% की रेंज में आम तौर पर अधिक है. पहले सफलता दर 25% के करीब हो सकता है. प्राथमिक ख़तरा है जब शुरुआत करने के लिए विकास कोन 'अधिक हेरफेर'. 'धक्का कदम' में प्रारंभिक बातचीत के कुछ ही सेकंड लेता है. विकास शंकु तो अकेला छोड़ दिया जाना चाहिए करने के लिए एक फर्म अनुलग्नक के रूप में. फिर धैर्य निम्नलिखित चरणों के दौरान प्रयोग किया जाना चाहिए.
- जब विकास शंकु सुई पर है, सही करने के लिए सुई हिल द्वारा इस पर एक मामूली तनाव डाल, और सुई एक छोटे से बढ़ा. सुई सुई आगे एक बिट चलती है जबकि जुटाने से 'नीचे' जाने के लिए क्षतिपूर्ति करना. चरणों में उठाएँ जब तक आप संलग्न सुई से पकवान की सतह से ऊपर सीधा विस्तार की प्रक्रिया है. अक्षतंतु अधोलंब व्यवस्था की सुइयों से रस्सा शुरू कर दिया है एक बार सटीक बल माप के लिए आवश्यक है, यानी कि एकमात्र लागू बल वेक्टर अक्षतंतु के अक्ष के साथ है विस्तार. यदि लाया प्रक्रिया सुई से दूर कोण, बल का एक वेक्टर सुई झुकने और कुल बल नहीं मापा जाता है के बजाय सुई के अक्ष के साथ पैदा होता है. प्रारंभिक पकवान लगाव के स्थान से दूर हो रही सुई के लिए एक स्थायी लगाव की संभावनाओं में सुधार. टिप पकवान (थोड़ा पकवान से कंपन या ध्यान की एक अलग विमान में देखा) की सतह से ऊपर या इसे कम से कम बल के साथ छू हो सकता है. बहुत तिरछा जाएगा सतह माप पर खींचें. पकवान, या सेल सब्सट्रेट करने के लिए reattaching प्रक्रिया के लिए चिपके हुए एक सुई के लिए यदि आप इसे स्थानांतरित करने की कोशिश कर रहा रखने लोड हो रहा है, जो फिर अचानक लगाव के संभावित नुकसान के साथ ढीला चबूतरे 'बल का नेतृत्व करेंगे. इस तरह के एक चिपके बिंदु से सुई मुक्त करने के लिए, सुई आगे बढ़ने और वापस अधिक बल (दाएं) को जोड़ने के बजाय ('अप' और स्क्रीन के विमान में 'नीचे').
- रस्सा सुइयों सेल शरीर से दूर जा रहा द्वारा बल के छोटे वेतन वृद्धि को लागू करने के द्वारा पूरा किया है. बलों obser हैंसुइयों के बीच एक बढ़ती हुई अंतर के रूप में वेद है. हालांकि धीरे - धीरे तनाव बढ़ रही है, ध्यान से सुई से विकास शंकु की टुकड़ी के किसी भी लक्षण के लिए निरीक्षण करते हैं.
- यदि विकास शंकु detaches और तेजी retracting नहीं है, तनाव थोड़ा कम होती है और प्रतीक्षा, अक्सर विकास शंकु पकड़ने 'होगा और टिप पर फिर से हड़पने. यदि अक्षतंतु बंद आता सुई सुई के साथ पकवान के खिलाफ फँसाने और दोहरा द्वारा यह retracts पहले इसे पकड़ने या 'पुश' एक 'पुल डाउन' करने के लिए उस पर एक छोटे से तनाव डाल दिया और फिर से लगाव के लिए के बारे में 10 मिनट इंतजार . दो असफल प्रयासों के बाद, हम एक अलग कक्ष का उपयोग की सलाह देते हैं.
- Counterbalance वाष्पीकरण के लिए प्रति घंटा पानी जोड़ने, पकवान की तरफ एक निशान का उपयोग करने के लिए प्रारंभिक गहराई से संकेत मिलता है पकवान में मीडिया स्तर बनाए रखें. एक लंबे पाश्चर विंदुक के साथ, पकवान के पक्ष में धीरे धीरे पानी जोड़ने के सुइयों से दूर. एक बार प्रक्रिया 'स्टालों' अगर मीडिया hyperosmotic हो जाता है का विस्तार. मीडिया की सतह पर एक तेल कोटिंग के साथ वाष्पीकरण कम किया जा सकता है, लेकिन इस के बाद सुई मीडिया में जोड़ा जा होगा. यदि सुई तेल के माध्यम से गुजरता है, विकास शंकु तक कम सुई करने के लिए संलग्न की संभावना है.
- एक प्रयोग के अंत में, इससे पहले कि आप सुइयों लिफ्ट बाहर के पकवान, पुनः जाँच शून्य दूरी.
- स्क्रीन पर क्षैतिज अक्ष, सेल शरीर की स्थिति और रिकार्ड समय के साथ सुइयों के पदों पढ़ें. सुई ऋण उतार शून्य सुई के लिए झुकने निरंतर से गुणा दूरी की जुदाई दूरी के बल के μdynes लागू किया जा रहा बराबर होती है. स्क्रीन छवि एक मंच सुक्ष्ममापी का उपयोग दूरी जांचना.
- बहुत महत्वपूर्ण गुणवत्ता डेटा (शून्य बल) के लिए संदर्भ की दूरी सुइयों के बीच जुदाई सुनिश्चित करने के प्रयोग के दौरान परिवर्तन नहीं करता है. थर्मल परिवर्तन माइक्रोन पैमाने पर उपकरणों को प्रभावित करेगा, यानी वातानुकूलन पर एक प्रयोग के दौरान बारी है. इसके अलावा, अगर अपने खुर्दबीन हीटिंग सिस्टम एक समय अंतराल है इंतजार जब तक आप थर्मल स्थिरता है. Ringcubator समय अंतराल घट जाती है और भी पकवान में थर्मल परिवर्तन खुर्दबीन और शून्य और ध्यान में परिवर्तन के थर्मल बहाव ह्रासमान हेरफेर प्रणाली के बाकी हिस्सों से आइसोलेट्स. एक और सुई उतार जुदाई फेरबदल बल सुई शाफ्ट पर सतह तनाव है. लोड डिश में तरल की गहराई के साथ बदलता है. सुइयों को समर्थन से दूरी संदर्भ जाँच हो रही है और अस्थायी तौर पर देख नहीं बल के एक प्रयोग के दौरान शून्य दूरी कभी कभी डेटा की गुणवत्ता में सुधार, भले ही आप जुदाई में एक परिवर्तन टिप्पण कर रहे हैं.
8. कोशिकाओं को संलग्न
9. एक अक्षतंतु या सेल की प्रक्रिया का विस्तार
10. डेटा विश्लेषण
11. प्रतिनिधि परिणाम:
बल कैलिब्रेटेड गिलास सुई आसानी से किसी भी सेलुलर क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता सकता है आम तौर पर विकास शंकु, के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सीधे कल्पना. सेलुलर अनुलग्नक प्राप्त करने के लिए सुई का उचित उपचार के साथ, यांत्रिक तनाव प्रयोगात्मक ब्याज की सेलुलर क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता है, या उस क्षेत्र द्वारा उत्पादित बलों मापा जा सकता है. एक प्रतिनिधि neuronal रस्सा चित्रा 1, जहां लाया अक्षतंतु दो घंटे में किया गया है लंबाई में दोगुनी प्रयोग में दिखाया गया है.
चित्रा 1 रस्से के लिए पसंदीदा अभिविन्यास के साथ एक सुसंस्कृत चिकन पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि सेल को चुना है. प्रारंभिक सुइयों के बीच शून्य संदर्भ दूरी पहले प्रयोगात्मक हेरफेर (ए) शुरू होता है दर्ज की गई है. 'पुश' पैंतरेबाज़ी विकास शंकु (बी) के लिए लागू किया जाता है. रस्सा वृद्धि हुई शक्ति के रूप में सुई (सी) की जुदाई ने संकेत दिया लोडिंग के साथ शुरू होता है. रस्सा अक्षतंतु बढ़ा दिया गया है, लाया अक्षतंतु और काम कर सुई की 'क्षैतिज' और सीधा संरेखण अच्छा बल माप (डी) में मदद की है. बार = 40 सुक्ष्ममापी. सुई अंशांकन = 6.9 μdyne / सुक्ष्ममापी.
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Discussion
तकनीक लागू करते हैं और सेलुलर बलों को मापने के लिए एक लंबे इतिहास 9 है. हमारी विधि मूल डेनिस ब्रे, जो कांच हमारा एक motorized हाइड्रोलिक 10 डिवाइस का उपयोग एक निरंतर दर पर 'टो' न्यूरॉन्स के लिए इसी तरह की सुइयों का इस्तेमाल के काम से प्रेरित था. Stepper 11 मोटर्स, चुंबकीय मोतियों 12, microfabricated मुस्कराते हुए 13 और तरल पदार्थ का प्रवाह 14: वहाँ कई कोशिकाओं जो शामिल करने के लिए बलों में लागू करने के वैकल्पिक साधन हैं . बाद हमारे दृष्टिकोण के समान में है कि सेलुलर जांच अंततः ज्ञात कठोरता के एक झुकने बीम के खिलाफ calibrated है और सेलुलर माप ऑप्टिकल सूक्ष्म टिप्पणियों पर निर्भर है. दूसरे दृष्टिकोण की तुलना में, हमारे 3 विधि का प्राथमिक लाभ के लिए एक साथ लागू करने और μdyne रेंज में (सूक्ष्मदर्शी और micromanipulators) जीवन विज्ञान विभागों के विशिष्ट उपकरण का उपयोग बलों को मापने की क्षमता है.
इन विधियों का प्रयोग, neuronal विकास शंकु द्वारा exerted बलों के रूप में वे अग्रिम 15 मापा गया है. तनाव के जवाब में axonal बढ़ाव दर के यांत्रिक रिश्ते को एक न्यूटोनियन तरल पदार्थ की तरह उत्तेजना - प्रतिक्रिया 7 संबंध का पालन करने के लिए निर्धारित किया गया है. तनाव के जवाब में axons की रिश्तेदार संवेदनशीलता चिकन 2 भ्रूण के परिधीय न्यूरॉन्स के लिए की तुलना में केंद्रीय मस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए अधिक से अधिक होना दिखाया गया था. Axons की त्याग भी 7 जांच की गई है . कोई निर्धारित axons साथ न्यूरॉन्स उनके axonal / वृक्ष के समान यांत्रिक तनाव की 5 आवेदन द्वारा नियंत्रित polarity कर सकते हैं. GFP-लेबल actin या ट्यूबिलिन व्यक्त fibroblasts में, हम सीधे cytoskeleton की सुई के रूप में अच्छी तरह से 8 तनाव के परिवर्तन करने के लिए अपनी प्रतिक्रिया के सरल लगाव के जवाब visualized. सेल संलग्नक या एक दूसरे को substrates के एक परीक्षण किया गया है. चलता - फिरता कोशिकाओं के आगे बढ़नेवाला बलों और जांच की जा सकता है आ filipodia के पुल 16 मापा जा सकता है . गतियों लाया axons भीतर लेबल mitochondria के द्वारा प्रदर्शित मॉडल आंतरिक सामग्री परिवहन (कम वेग परिवहन) करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और निर्धारित करती है कि न्यूरॉन्स axonal 6,17 शाफ्ट की लंबाई के साथ intercalated जन अलावा बढ़ने है.
बस उन्हें मापने के बिना बलों को लागू करने में रुचि रखते जांचकर्ताओं के लिए, संदर्भ सुई का उपयोग 18 की आवश्यकता नहीं है. इसके विपरीत, यदि बल माप वांछित हैं संदर्भ सुई सटीक डेटा उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. कुल मिलाकर, हम निरपेक्ष बल माप में त्रुटि का अनुमान है 5 से डेटा को पढ़ने की प्रक्रिया में उत्पन्न होने वाली त्रुटि का सबसे बड़ा स्रोत के साथ 10% की सीमा में होना. कठिनाई ठीक defocused संदर्भ सुई के स्थान की पहचान और छोटे वापस और सुइयों के आगे आंदोलनों (कंपन) के प्रभाव को कम करने में है. एक संदर्भ सुई के बिना त्रुटि के इन स्रोतों भी बड़ा होगा.
प्रायोगिक जोड़तोड़ रस्सा सत्र के साथ समाप्त की जरूरत नहीं है. Towed विकास शंकु अन्य कोशिकाओं को संलग्न किया जा सकता है या 5 पकवान reattached . इस जोड़ तोड़ अवसर का उपयोग करना, neuronal circutry सूक्ष्म जानबूझकर, विन्यस्त किया जा सकता है अलग अलग सेल प्रकार की जांच के पार बात की अनुमति है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम इस पद्धति के विकास में आभार डॉ. रॉबर्ट ई. Buxbaum के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
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