Summary
Aplicação e medições diretas de forças sobre os neurônios na faixa Microdyne 2000-1000 são obtidos com alta precisão usando agulhas de vidro calibrado. Esta metodologia pode ser usada para controlar e medir vários aspectos do desenvolvimento axonal, incluindo a iniciação axonal, a tensão axonal, a velocidade de alongamento axonal, e vetores de força.
Abstract
Manipulações de células e extensão de axônios neuronal pode ser realizado com vidro calibrado micro-fibras capazes de medir e aplicação de forças na faixa de 1,2 1-10 μdyne. Medidas de força são obtidos através da observação da Hookean flexão das agulhas de vidro, que são calibrados por um método direto e empírica 3. Requisitos de equipamentos e procedimentos para a fabricação, calibração, tratamento e usando as agulhas sobre as células estão completamente descritos. A força de regimes tipos de células usadas anteriormente e diferente para que estas técnicas foram aplicadas demonstrar a flexibilidade da metodologia e são dados como exemplos para futuras investigações 4-6. As vantagens técnicas são as "visualização" contínua das forças produzidas pelas manipulações ea capacidade de intervir diretamente em uma variedade de eventos celulares. Estes incluem a estimulação direta e regulação do crescimento axonal e retração 7, assim como desapego e medições mecânicas em qualquer tipo de células cultivadas 8.
Protocol
1. Fazer agulhas de vidro.
- Um extrator de micro-agulha ajustável é usado para fabricar agulhas com ponta cônica de cerca de 4 mm de comprimento e que estão fechados vigas sólidas. Em oposição a uma ponta longo e flexível, esta curta 4 mm de comprimento limites vibrações da ponta da agulha durante as experiências. Na região proximal da fibra de 4 mm, a agulha se reduz rapidamente a partir do diâmetro do tubo de vidro de 15 mm em 1 mm, enquanto que o distal mais de 1 mm da fibra é de 2,5 m de diâmetro. Usamos R-6 tubo capilar de vidro, 0,9 mm OD, ID 0,6 milímetros de comprimento 8 "e um puxador de BB-CH. Se o investigador está interessado em faixas de medição de outra força, agulhas com propriedades diferentes da primavera (ou seja, de um tamanho diferente e ou ) espessura deve ser puxado. Cada tubo capilar puxa em quatro 2 "agulhas. Agulhas são armazenados em pratos cobertos 160 milímetros Petri com 'cobras' duas massa de modelar em que as agulhas são levemente pressionados.
- As agulhas de vidro, bem como uma agulha de arame a ser descritos, são essencialmente vigas usadas como molas de flexão de rigidez apropriada para as medições desejadas da força. Note-se que a força de flexão de um feixe de escalas como o cubo de seu comprimento, independentemente da sua composição. Assim, para qualquer uma das etapas de calibração descritos a seguir, um feixe de agulhas / de rigidez insuficiente pode ser mais rígida por uma pequena quantidade de gordura (por exemplo, uma redução de 10% produz um aumento de 28% na rigidez, ou seja, 0,9 3).
2. Fazer e calibrar uma agulha de arame
- Faça uma agulha de calibração fio através da inserção de um 0,001 "fio Chromel pelo interior de uma agulha de vidro (feito na seção 1.1) com a ponta quebrada. Puxe o fio para fora da ponta para um comprimento de 26 mm e cola-lo no lugar com super-cola. Dobre o distal um milímetro do fio em um gancho.
- Tornar micro-pesos de 1 metro de fio de 0,003 Constantan ". Para medir o fio, fita-lo a um metro vara para ajudar na obtenção em linha reta possível. Pesar o 1 m de arame, com precisão cortá-lo para uma peças cm, e dobrar várias peças em Vs
- Calibrar as agulhas fio requer um microscópio de dissecação com um retículo de medição e um micromanipulador. O microscópio está inclinado 90 ° em seu lado com um stand explosão universal, de tal forma que uma deflexão para baixo da agulha de arame podem ser observados. Montagem da agulha de arame no ponto 2.1 em um porta-ferramenta em um micromanipulador de tal forma que a região é viciado perpendicular ao eixo óptico do microscópio. Line up o gancho da agulha de arame com uma marca de retículo. Pendure a um centímetro de peso micro-no gancho e registrar a deflexão. A constante flexão (μdynes / mm) do fio de referência é calculado como a razão entre o peso micro-(nota: 1 mg = 0,98 dinas) dividido pelo desvio observado (mm). Para preparar a agulha de arame para o próximo passo, corte o gancho no ponto de pesar com um bisturi. A presença do gancho é o peso adicional que se inclina o fio em pequeno grau. Assim, os efeitos da posição inicial do fio no retículo antes o peso é adicionado. A medição da constante da mola de arame é derivado de deflexão do fio quando o peso é adicionado ao ponto de dobrar (ponta futuro do fio). Quando o gancho é cortado isso não muda a primavera constante do fio.
3. Calibrar as agulhas de vidro intermediária
- Calibração das agulhas de vidro intermediária requer o uso de um microscópio invertido com uma retícula ocular. De um lado do palco microscópio é um micromanipulador mecânicos utilizados para segurar a agulha de arame da seção 2 no centro do campo óptico. Do outro lado é um micromanipulador hidráulico de três eixos (ver tabela de equipamentos) usados para mover a agulha de vidro intermediária que está sendo calibrado. Usando o micromanipuladores, trazer ambas as agulhas juntos no centro do campo visual em um ângulo de 45 ° ~ em um 160 mm x 30 mm placa de Petri de água em um campo de 10x.
- Uma série de agulhas puxado com configurações diferentes no extrator pipeta é gerado pela primeira vez para a avaliação. O objetivo é fazer com que uma agulha de vidro intermediário com uma mola de flexão constante de 20-30 μdynes / M. Determinação da rigidez é feito medindo a relação entre a deflexão da agulha intermediários em comparação com a deflexão da agulha de arame. Por exemplo, com as agulhas de arame e vidro tocar, a agulha de vidro é movido para desviar a agulha de arame a uma distância de 5 marcas no retículo como pode ser visto através das peças do olho. Movendo a agulha de vidro lateral desengata a agulhas. A agulha de arame, em seguida, retorna à sua posição original de partida, mas a agulha de vidro estará agora em uma nova posição. A carga sobre a agulha de vidro é então calculada a partir da sua posição de zero da força de novo menos a posição de ambas as agulhas com carga igual força (ambas as agulhas envolvidos). Neste exemplo, se ambas as agulhas são desviados para marcar 5 (de zero sobre o retículo), a agulha de arame irá retornar a zero, enquanto o glass agulha pode Primavera a 25, em caso afirmativo, é dobrado 20 marcas com a mesma força que o fio de agulha flexionado cinco marcas. Portanto, a relação de flexão entre as duas agulhas dá a calibração da agulha de vidro e é ¼ tão duro como a agulha de arame. Porque os cálculos constante da mola no ponto 3.4 usar rácios de distâncias são independentes de ampliação ou tamanho divisão retículo. A única consideração limitante é que as deformações são pequenas o suficiente para estar na faixa linear elástico do agulhas.
- Fazer uma série de deformações nas posições de 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 marcas no retículo. Se o desvio de liberação prematuramente repetir aquelas. Entre deflexões manter a agulha de arame alinhado na zero. Para cada um desses desvios, note a quantidade desviada ea posição zero-carga final da agulha de vidro após o lançamento. Isso cria 10 pares de pontos de dados. Seqüências podem ser utilizadas outras, mas esta série foi concebida para dar os primeiros indícios de consistência interna, linearidade e histerese (resultados de deflexões 5 + 10 = 15; 3 +7 = 10; o 5,10,15 deflexões após a liberação deve ser de aproximadamente o mesmo no início e final).
- Regressão linear dos desvios registrados na seção 3.3 fornece uma quantificação mais precisa da constante flexão da agulha de vidro intermediária do que uma relação de deflexão único. Ele também fornece uma avaliação da linearidade da agulha e da qualidade da calibração indicada por um valor maior r e proximidade do intercepto da linha de regressão para zero. Para preparar os 10 pares de dados da seção 3.3 para a regressão, o segundo número dos pares de gravada, a posição zero de carga final da agulha de vidro após o lançamento, deve ter a deflexão inicial correspondente subtraído, o que é o primeiro número de o par. Uma vez que esta operação seja realizada o conjunto de pares novo número consistem na deformação inicial ea diferença correspondente calculado. Adicionar 5 pares de controle de 0,0 a esses 10 pares de dados experimentais para ancorar a regressão linear em zero para zero força de deflexão. Isto não é absolutamente necessário, mas acrescenta um grau extra de precisão. Ancoragem em 0,0 se baseia no princípio de que a agulha não é dobrado quando a força não é aplicado. Com estes 15 pares de dados calcular uma regressão linear. A mola de flexão constante da agulha de vidro sendo calibrado é a agulha de arame é conhecido constante flexão dividido pela inclinação da linha de regressão.
4. Calibrar a agulha trabalhar vidro usado para manipular neurônios
- Agulhas de vidro do cumprimento suficiente, 15/02 μdynes / M, para ser usado experimentalmente em neurônios são calibrados com a agulha de vidro intermediária de maneira análoga, conforme descrito na seção 3. Ou seja, as agulhas trabalhando candidato desviar uma agulha de rigidez intermediária conhecida colocado na posição da agulha de arame na seção 3. Agulhas de vidro de menos de 2 μdynes / M pode ser ligeiramente encurtado para trazê-los para a faixa de rigidez apropriada.
5. Agulhas são pré-tratados com fatores de penhora
- Agulhas para ser tratado são pressionados para o lado de um pedaço de barro realizada em uma braçadeira set acima de um copo de 10 ml de solução de fixação fator, de tal forma que apenas a ponta da agulha está imersa na solução. Imergindo o eixo do tubo capilar é indesejável porque aumenta o acúmulo de revestimento na ponta ao longo do tempo, que muda a rigidez e diminui a eficácia da agulha do apego. Uma agulha calibrados só podem ser utilizados cerca de 4 vezes e pode ser recalibrado para a exatidão. As agulhas são mergulhados em seqüência em 0,1% solução polilisina por 30 minutos e, em seguida, concanavalina A (1 mg / ml em PBS) por 30 minutos. A polilisina pode ser usado repetidamente por várias semanas e é armazenada a -20 ° C. Faça ConA semanal fresco e armazenar a 4 ° C. Para outros tipos de células das moléculas apresentadas à sua superfície pela agulha pode dirigir o curso da investigação.
6. Equipamento configurado
- O posto de trabalho de reboque é configurado em uma mesa de isolamento de vibração. Ele consiste de um microscópio invertido equipado com um bar no lado esquerdo acima do palco e um manipulador hidráulico ligado a ele, segurando nossa extensão contrabalançado personalizado, em que o porta-ferramenta dupla está inserido. Posição do micromanipulador hidráulico ao longo da barra, colocando uma agulha em seu titular em caminho da luz do microscópio, enquanto os controles do manipulador estão centradas em seus intervalos. No momento em que a agulha esteja sendo tratada com fatores anexo, ligue o microscópio Ringcubator ou outros sistema de aquecimento de estágio, de modo que o estágio está em equilíbrio térmico no início dos experimentos.
7. Alinhando as agulhas
- O objetivo é fazer com que as duas agulhas (a referência e agulha de trabalho) no campo visual do microscópio, dispostas de formasuas dicas são cerca de 50 mm de distância, separados, com a referência acima da placa de cultura, portanto, um pouco fora de foco quando a agulha de reboque está em foco no prato. As duas agulhas em sua titulares agulha são montadas em um suporte Leica duplo-ferramenta, que é em si um micromanipulador de pequeno porte. Usando a micromanipulação do titular duplo ferramenta, as duas pontas são trazidas para o alinhamento paralelo. Inserir a agulha de referência em um suporte de agulha a uma curta distância, o suficiente para permitir que o colar de aperto para agarrá-lo e colocar esta montagem no lado direito do titular ferramenta de casal. Inserir a agulha tratados trabalhando metade do seu comprimento no suporte da agulha e coloque-o no lado esquerdo do porta-ferramenta de casal. Quando as duas pontas de agulha são trazidos para a mesma posição para a frente e alinhados, os diferentes comprimentos das agulhas em seus titulares escalonar os colares que eles não impedem ficando as pontas muito próximas entre si. Seções 7.2 a 7.4 serão feitas sem ampliação. 7,5-7,8 seções são feitas sob observação microscópica.
- Pré-definir o micromanipulador hidráulico para o controle vertical é todo o caminho até. Definir a outros controles para o centro de sua escala, e também o avanço / parafuso de trás do suporte da ferramenta.
- Traga as duas pontas de agulhas em conjunto usando o parafuso de ajuste lateral no lado direito da porta-ferramenta. Em seguida, empurrar o porta-agulhas-se para frente ou para trás no porta-ferramenta dupla conforme necessário para trazer a agulha de dicas para a mesma posição para a frente. Examine o par de lado e usar o lado direito para cima / baixo parafuso para trazer as dicas para o mesmo plano. Girar titulares agulha no porta-ferramenta para fechar a lacuna se uma agulha em ângulos de seu titular agulha.
- Balançar o suporte de ferramenta e coloque a ponta para o caminho da luz acima da superfície da mídia, dobrando-los abruptamente. Aperte o parafuso de junta esférica na base antes de mover a mão.
- Encontrar dicas sua agulha no campo visual do microscópio, antes de levá-los muito baixo e quebrá-las ou falta deles com detritos no fundo do prato cultura. Em um prato de 60 mm, 15 ml de meio de profundidade fornece suficiente para uma margem de segurança acima do fundo do prato. Fazer uma prática inicial com uma agulha não calibrada para obter a sensação desta etapa. Comece concentrando-se para cima, acima das células no fundo do prato com o objectivo a10x. Fazei isto em uma área do prato longe sensível à luz ou exemplares células experimentais. Abaixe a agulhas na mídia. Mover o lado agulhas para o lado à procura de sua sombra. Se você não vê-los, reduzi-los um pouco e movê-los para a frente no prato, repita o lado a lado passam. Encontrar a ponta, movendo-se para trás (ou a prazo) e para baixo.
- Rode o parafuso de um lado para outro para ver qual a agulha que você encontrou. Se ele se move com o parafuso você está olhando para a agulha de referência, se não é a agulha calibrado. Para a agulha calibrada, use o lado a lado para o parafuso empurre a agulha de referência em direção a ela. Movê-lo para a frente e para trás procurando a sombra de referência. Se é a agulha de referência que você encontrou, parafuso para a esquerda enquanto se move a hidráulica para a direita procurando a agulha calibrado.
- Quando ambas as agulhas estão localizados usar os controles de multa de porta-ferramentas duplo para alinhá-los. O ângulo íngreme das agulhas vindo ao longo da borda do prato faz com que o up / controle para baixo para também ter um para a frente, alongando componente para o ajuste para cima e para baixo com um encurtamento. Do lado esquerdo, frente / para trás do controle do parafuso tem a frente, empurrando a ponta para a frente também é baixo no prato, puxando-o de volta retira a agulha, enquanto a elevar a posição da dica. Portanto, elevar a referência e fazer avançar a agulha calibrado irá prolongar tanto para torná-los ainda nas pontas ao mesmo tempo, trazendo-os para o relacionamento ideal de altura acima do prato. Se a agulha de referência se estende muito além da agulha funcionando, você pode parafuso / empurre a agulha a trabalhar para baixo e para frente, enquanto balançando a referência para baixo e encurtando-lo até que os dois estão mesmo ea agulha de trabalho é menor. Às vezes a faixa parafusos não vai trazer as agulhas juntos, então você pode precisar de deslize suavemente os titulares se, certifique-se o parafuso de junta esférica é bem apertado e use os dedos prensada contra a borda do porta-ferramentas para aplicar a força para deslizar o eixos. Você também pode rodar o porta-agulhas no porta-ferramenta como antes, enquanto na mídia e observando o efeito, ver se eles estão ficando mais próximos.
- Gravar a imagem desta posição final ajustado, a separação das agulhas sem qualquer força aplicada é a distância de referência zero. Levantar as agulhas acima do plano de amostra e 'parque' deles na beira do campo visual.
- Detritos em uma agulha pode ser removido por elevá-lo através do menisco. Primeiro mover a agulha de referência de distância da outra agulha para evitar as duas pontas trancando em si. Várias passagens podem ser necessárias. </ Ol>
- Até este ponto, as agulhas foram observadas diretamente através do microscópio. Começando com adesão celular, as observações serão feitas tanto através do microscópio e na tela de vídeo. O aspecto esquerda / direita de ambos é idêntico, mas a orientação para cima / baixo da imagem na tela de vídeo não é o mesmo que (gravitacional) para cima e para baixo no microscópio. Para esclarecer as diferenças entre as direções para cima / baixo como observado diretamente através do microscópio e como pode ser observado na tela de vídeo, este será referido como 'up' e 'down', isto é, entre aspas
- O processo de reboque é feito através da alteração da posição das duas agulhas da esquerda para a direita ("horizontal") na tela de vídeo. Conseqüentemente, a escolha do axônio experimental é feita, em parte, o axônio que se estende na mesma direção 'horizontal'. O axônio pode desviar-se 'para baixo' de 'horizontal' por tanto como 15 °, já que esta será compensada pelo 'push up' manobra da seção 8.5. Além disso, o axônio escolhido para manipulação deve ser o comprimento de um corpo celular, ou mais, com um cone de crescimento ativo. Axônios que se estende ao direito do corpo celular são preferidos devido à criação do porta-ferramentas duplo com a agulha de trabalho montado para a esquerda da agulha de referência, como tensão que aplicado durante o reboque se alarga o fosso entre as duas agulhas.
- A principal axônio que se estende até a esquerda do corpo da célula pode ser rebocado sem reorientar o titular duplo ferramenta criada por alargar o fosso entre as agulhas e levantando a agulha de referência um pouco. Isso permite que o espaço agulha de reboque mais a flexão em direção à referência e passar por baixo, se necessário. A reboque, então, avançar para a esquerda ea agulha de reboque vai se curvar em direção a agulha de referência à medida que aumenta a tensão. Ao analisar os dados dessa mudança na relação de tensão à distância de referência é inserida na planilha subtraindo-se a medida de separação agulha da distância de referência zero em vez da distância zero a partir da medição.
- Mover as agulhas perto do cone de crescimento do axônio, registrar a distância zero de novo, levantar as agulhas, e do ar até a mesa de isolamento de vibração.
- Basta colocar a agulha a trabalhar na frente de um cone de crescimento pode produzir avanço apego espontâneo como os avanços cone de crescimento. A pró-ativamente manipular um anexo para o cone de crescimento, coloque a agulha de reboque para baixo "abaixo" o cone de crescimento e abaixe a agulha contra o fundo do prato. Isso fará com que a agulha para desviar 'up', dobrando e deslizando ao longo do prato para o cone de crescimento, deslocando-lo e movê-lo 'para cima'. Pressionar a agulha contra o fundo prato apenas o suficiente para que o cone de crescimento ganchos em torno da ponta da agulha, mas não tão longe que desliza sobre a agulha e desliza para trás. Aguarde 20 minutos para que um aperto se estabelecer. Com a experiência, a taxa de sucesso pode ser tão alta quanto 90%, mas é mais tipicamente na faixa de 75%. No início, a taxa de sucesso pode estar mais perto de 25%. A armadilha principal quando começo é a 'mais manipular "o cone de crescimento. A interação inicial no "passo push up 'leva alguns segundos. O cone de crescimento deve ser deixado sozinho para formar uma fixação firme. Em seguida, a paciência deve ser exercido durante as etapas seguintes.
- Quando o cone de crescimento é na agulha, coloque uma leve tensão sobre ele, movendo as agulhas para a direita, e levantar a agulha um pouco. Compensar a agulha em movimento "descendente", movendo a agulha para a frente um pouco ao levantar. Elevar em etapas até ter o processo anexado estendendo perpendicular da agulha e acima da superfície do prato. O arranjo perpendicular do axônio que se estende desde as agulhas uma vez reboque começou é necessário para medições precisas força, isto é, de modo que o vetor única força aplicada é ao longo do eixo do axônio. Se os ângulos processo rebocado da agulha, um vetor da força que nasce ao longo do eixo da agulha ao invés de dobrar a agulha ea força total não é medido. Ficar longe do local do anexo prato inicial melhora as perspectivas de um anexo duradoura para a agulha. A ponta pode ser acima da superfície do prato (observados em vibrações pouco ou um plano diferente do foco do prato) ou tocá-lo com o mínimo de força. Demasiado arrasto na superfície, distorcem as medições. Uma agulha aderindo ao prato, ou processo de célula reattaching ao substrato irá levar a força de carga, se você continuar a tentar movê-lo, o que, de repente, "aparece solto" com a possível perda do anexo. Para liberar a agulha de um tal ponto de fricção, mover a agulha para a frente e para trás ("para cima" e "para baixo" no plano da tela) em vez de adicionar mais força (direita).
- Reboque é feito através da aplicação de pequenos incrementos de força, movendo as agulhas para longe do corpo celular. Forças são observed como um fosso crescente entre as agulhas. Enquanto, gradualmente, aumentando a tensão, observar cuidadosamente para detectar quaisquer sinais de descolamento do cone de crescimento da agulha.
- Se o cone de crescimento se destaca e não é rapidamente retraindo, diminuir a tensão um pouco e esperar, muitas vezes o cone de crescimento será "catch up 'e agarrar a ponta novamente. Se o axônio sai a agulha pegá-lo antes que ele se retrai, aprisionando-o contra o prato com a agulha e repetir o "push up" ou um "pull down" para colocar um pouco de tensão sobre ele e espere cerca de 10 min para o re-attachment . Depois de duas tentativas fracassadas, recomendamos usar uma célula diferente.
- Manter o nível de mídia no prato por adição de água por hora para contrabalançar a evaporação, utilizando uma marca no lado do prato para indicar a profundidade inicial. Com uma pipeta Pasteur longa, lentamente adicionar água ao lado do prato de distância das agulhas. Extensão de um processo muitas vezes "bancas" se a mídia se torna hiperosmótico. Evaporação poderia ser diminuído com uma revestimento de óleo na superfície da mídia, mas isso teria de ser adicionadas após a agulha está na mídia. Se a agulha passa através do petróleo, o cone de crescimento é muito menos provável para anexar à agulha.
- No final de um experimento, antes de levantar as agulhas fora do prato verifique novamente, a distância zero.
- Leia as posições das agulhas ao longo de um eixo horizontal na tela, a posição do corpo celular e os tempos de registro. A distância de separação das agulhas menos a distância de zero descarregado multiplicado pela constante flexão para a agulha é igual ao μdynes de força a ser aplicada. Calibrar as distâncias da imagem no ecrã utilizando um micrômetro palco.
- Muito importante para a qualidade dos dados é garantir a distância de referência (zero vigor) separação entre as agulhas não muda durante o experimento. Alterações térmicas afetará o equipamento na escala de mícron, ou seja, não ligar o ar condicionado durante um experimento. Além disso, se seu sistema de aquecimento microscópio tem um tempo de atraso de esperar até ter estabilidade térmica. O Ringcubator diminui o tempo de atraso e também isola a alterações térmicas no prato do resto do microscópio e sistema de manipulação de diminuir drift térmico do zero e mudanças no foco. Outra força alterando separação descarregado a agulha é a tensão superficial nos eixos agulha. A carga varia com a profundidade do líquido no prato. Verificar a distância de referência, fazendo o backup das agulhas e, temporariamente, vendo a distância nenhuma força-zero, ocasionalmente, durante um experimento melhora a qualidade dos dados, mesmo se você está notando uma mudança na separação.
8. Inerentes às células
9. Estendendo um processo axônio ou célula
10. Análise de Dados
11. Resultados representativos:
A força-calibrado agulhas de vidro pode ser facilmente aplicado a qualquer região de celular, geralmente o cone de crescimento, como visualizados diretamente por microscopia de luz. Com tratamento adequado da agulha para obter a adesão celular, a tensão mecânica pode ser aplicado experimentalmente para a região celulares de interesse, ou as forças produzidas por essa região pode ser medido. Um representante experimento reboque neuronal é mostrado na Figura 1, onde o axônio rebocado foi duplicada no comprimento em duas horas.
Figura 1. A cultura de células de galinha dorsal gânglio da raiz com a orientação preferencial para reboque é escolhido. A distância de referência inicial zero entre as agulhas é gravado antes da manipulação experimental começa (A). «Push up 'manobra é aplicada ao cone de crescimento (B). Reboque de carga inicia-se com maior força, como indicado pela separação das agulhas (C). Reboque ampliou o axônio, os alinhamentos 'horizontal' e perpendicular do axônio rebocadas e agulha de trabalho têm facilitado medidas de força boa (D). Bar = 40 mM. Calibração agulha = 6,9 μdyne / M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Técnicas para aplicar e medir forças celulares têm uma longa história 9. Nosso método foi originalmente motivado pelo trabalho de Dennis Bray, que usou agulhas de vidro semelhante ao nosso para "rebocar" os neurônios em uma taxa constante através de um dispositivo motorizado hidráulico 10. Existem muitos meios alternativos de aplicação de forças para as células que incluem: motores de passo 11, 12 esferas magnéticas, vigas microfabricated 13 e fluxos de fluido 14. Estes últimos são semelhantes à nossa abordagem em que a sonda celular é, em última análise calibrado contra uma viga de rigidez de flexão conhecidos e as medições celulares dependem óptico observações microscópicas. Em comparação com outras abordagens, a principal vantagem do nosso método 3 é a capacidade de, simultaneamente, aplicar e medir forças na faixa μdyne utilizando equipamentos (microscópios e micromanipuladores) típicas dos departamentos de ciências da vida.
Usando esses métodos, as forças exercidas por cones de crescimento neuronal à medida que avançam foram medidos 15. A relação mecânica da taxa de alongamento axonal em resposta a tensão foi determinada a seguir um fluido newtoniano-like relação estímulo-resposta 7. A sensibilidade relativa de axônios em resposta a tensão mostrou-se maior para os neurônios do cérebro central do que para os neurônios periféricos do embrião de galinha 2. Retração de axônios também tem sido investigada 7. Neurônios com axônios não pode ter determinado sua polaridade axonal / dendríticas controlada pela aplicação de tensão mecânica 5. Em fibroblastos expressando GFP-rotulados de actina ou tubulina, nós diretamente visualizados a resposta do citoesqueleto ao apego simples da agulha bem como a sua resposta às mudanças de tensão 8. Anexos célula para outra ou substratos foram testados 1. As forças de propulsão de células móveis podem ser examinados e a atração de filipodia aproximando poderia ser medido 16. As moções apresentadas pela mitocôndria rotulados dentro axônios rebocado têm sido usados para modelar o transporte de material interno (transporte de baixa velocidade) e determinar que os neurônios crescem por adição de massa intercaladas ao longo do comprimento do eixo axonal 6,17.
Para os pesquisadores simplesmente interessado em aplicar forças sem medi-los, o uso da agulha de referência não é necessária 18. Em contraste, se medidas de força são desejados a agulha de referência é essencial para gerar dados precisos. No geral, estimamos o erro nas medições força absoluta para estar na faixa de 5% a 10% com a maior fonte de erro que surgem no processo de leitura de dados. A dificuldade está em identificar precisamente a localização da agulha de referência defocused e minimizando os efeitos da volta pequena e para trás movimentos (vibrações) das agulhas. Sem uma agulha de referência, estas fontes de erro seria ainda maior.
Manipulações experimentais não precisam terminar com a sessão de reboque. Cones de crescimento rebocado pode ser conectado a outras células ou recolocado ao prato 5. Usando esta oportunidade manipuladora, circutry micro-neuronal pode intencionalmente ser configurado, permitindo conversas cruzadas de diferentes tipos de células a serem examinadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos as importantes contribuições do Dr. Robert E. Buxbaum no desenvolvimento desta metodologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
