Summary
Применение и прямых измерений сил на нейроны в диапазоне 2-1000 microdyne достигаются с высокой точностью с использованием калиброванных иглы стекла. Эта методика может быть использована для контроля и измерения ряда аспектов аксонального развития, в том числе аксонального инициации, аксонального напряжение, скорость аксонального удлинения и векторов сил.
Abstract
Сотовые манипуляций и расширение нейронных аксонов может быть выполнена с калиброванный стеклянный микро-волокна, способный измерять и применения силы в диапазоне 10-1000 1,2 μdyne. Группы измерений получены через наблюдение Hookean изгиб стекла игл, которые калибруются по прямой и эмпирический метод 3. Требования к оборудованию и процедурам для изготовления, калибровки, обработки и использования игл на клетки полностью описаны. Силу режимов ранее использовались и различные типы клеток, в которой эти методы были применены продемонстрировать гибкость методологии и приводятся в качестве примеров для будущего расследования 4-6. Технические преимущества непрерывной "визуализации" из сил, создаваемых манипуляций и возможность непосредственно вмешиваться в различных клеточных событий. К ним относятся прямой стимуляции и регулирования рост аксонов и втягивание 7; а также отряд и механических измерений на любом типе культурной ячейке 8.
Protocol
1. Создание стеклянной иглы.
- Регулируемые микро-иглы съемник используется для изготовления игл с коническим наконечником около 4 мм в длину и, которые закрыты твердых лучей. В отличие от длинным гибким кончиком, этой короткой длиной 4 мм пределы колебания иглы в процессе экспериментов. В проксимальной области 4 мм волокна, иглы быстро сужается от диаметра стеклянной трубки до 15 мкм в пределах 1 мм, а дистальная-не более 1 мм, волокна составляет 2,5 мкм в диаметре. Мы используем Р-6 стеклянных капилляра, OD 0,9 мм, 0,6 мм ID 8 "длиной и BB-CH съемника. Если следователь заинтересован в другие диапазоны измерения силы, иглы с различными свойствами весной (то есть разной длины и или толщина) должен быть подтянут. Каждый капилляр тянет на четыре 2 "иглы. Иглы храниться в крытых 160 мм чашки Петри с 'змей' два пластилина, в котором иглы легком нажатии.
- Стеклянные иглы, а также проволока иглы, которые будут описаны, по существу, пучки используются в качестве изгиба пружины соответствующей жесткости для требуемого измерения силы. Обратите внимание, что изгиб силу луч масштабах, как куб ее длины, независимо от состава. Таким образом, для любого из шагов калибровки, описанных ниже, иглы / луч недостаточной жесткости может быть жесткой на небольшую величину сокращения (например, 10% сокращение производит 28%-ное увеличение жесткости, то есть 0,9 3).
2. Изготовление и калибровки проволоки иглы
- Сделать иглы провод калибровки, вставив 0,001 "хромель провод через внутри стеклянной иглы (сделано в разделе 1.1) с его кончика прерваны. Вытяните провод из наконечника длиной 26 мм и приклейте ее на место с супер клей. Бенд дистальной 1 мм проволоку в крюк.
- Сделать микро-весом от 1 метра 0,003 "проволока константан. Для измерения проволоки, прикрепить ее к метр палки, чтобы помочь в получении его прямо насколько возможно. Взвесьте 1 м провода, аккуратно нарезать его на 1 шт см и согнуть несколько штук в Vs
- Калибровка проволоки иглы требует вскрытия микроскоп с измерительной сеткой и микроманипулятора. Микроскопа наклонены на 90 ° на своей стороне с помощью универсального стенда бум, так, что отклонение вниз провод иглу можно наблюдать. Горы проволоки иглы п. 2.1 в инструмент держатель на микроманипулятора, что подключили регионе перпендикулярно оптической оси микроскопа. Выстроить крючок проволоки игла с визирной марки. Повесьте 1 см микро-вес на крюке и записывать отклонения. Изгиба постоянной (μdynes / мкм) ссылка проволоки рассчитывается как отношение веса микро-(обратите внимание: 1 мг = 0,98 дин), разделенное на наблюдаемые отклонения (мкм). Для подготовки проволоки игла для следующего шага, отрезать крючок на взвешивании точки с помощью скальпеля. Наличие крючок дополнительного веса, что изгибы провода к малой степени. Таким образом, эффекты начальное положение проволоки в сетку перед вес не добавляется. Измерение постоянного пружинной проволоки является производным от отклонения проволоки, когда вес добавляется точка изгиба (будущий кончик провода). Когда крючок отрезал он не меняет пружины из проволоки.
3. Калибровка промежуточных иглы стекла
- Калибровка промежуточных иглы стекла требует использования инвертированный микроскоп с глазной сетки. На одной стороне столике микроскопа является механический микроманипулятора используется для хранения проволоки иглы раздела 2 в центре оптического поля. С другой стороны трем осям гидравлического микроманипулятора (см. таблицу оборудования) используются для перемещения иглы промежуточных стеклянных быть откалиброван. Использование микроманипуляторами, принести как иглы вместе в центре оптического поля на ~ 45 ° углом в 160 мм х 30 мм чашки Петри воды в 10 раз поле.
- Серия иглы вытащил с разными настройками на съемник пипетки первоначально создаются для оценки. Цель состоит в том, чтобы сделать промежуточные иглой стекло с изгиба пружины на 20-30 μdynes / мкм. Определение жесткости достигается путем измерения соотношения отклонения промежуточных иглы по сравнению с отклонением проволоки иглы. Например, с помощью проволоки и стекла иглы трогательные, стеклянная игла перемещается, чтобы отвлечь проволоки иглы расстоянии 5 знаков на сетку, увиденной глазами кусочки. Перемещение иглы в сторону стекла отключается иглы. Проволоки иглы затем возвращается в исходное исходное положение, но стекло иглы теперь будет в новой должности. Нагрузка на стекло иглы рассчитывается из его новой нулевой позиции силы минус позиции обеих игл при равной нагрузке силой (как иглы занимается). В этом примере, если обе иглы отклоняются по случаю 5 (от нуля на сетку), проволоки иглы вернется к нулю, а GLAсс игла может весной до 25 лет, если так, то изогнутые 20 марок с той же силой, что согнутой проволоки иглы 5 марок. Таким образом, соотношение изгиба между двумя иглами дает калибровки стеклянных иглу, и это ¼ как жесткая, как проволока иглы. Поскольку пружины расчеты в разделе 3.4 использовать соотношения расстояний они не зависят от увеличения или сетки размером деления. Только предельная рассмотрения является то, что отклонения достаточно малы, чтобы быть в линейный упругий спектр иглы.
- У ряда отклонений в позиции 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 знаки на сетки. Если какие-либо отклонения выпуска преждевременно повторять их. Между отклонений держать провод иглы выровнены по нулю. Для каждого из этих отклонений, обратите внимание на количество отклоненных и окончательного нулевой нагрузке положение стекла иглой после освобождения. Это создает 10 пар точек данных. Другие последовательности могут быть использованы, но эта серия была разработана, чтобы дать первые признаки внутренней согласованности, линейности и гистерезиса (результаты отклонения 5 + 10 = 15; 3 +7 = 10; 5,10,15 отклонений после освобождения должны быть примерно же в начале и в конце).
- Линейная регрессия записаны отклонения от раздела 3.3 дает более точную количественную оценку изгиб Константа промежуточных иглой стекло, чем один коэффициент отклонения. Она также обеспечивает оценку линейности иглы и качество калибровки указывает высокое значение т и близость перехват линии регрессии к нулю. Для приготовления 10 пар данных из раздела 3.3 для регрессии, второе число зарегистрированных пар, окончательное нулевой нагрузке положение стекла иглой после освобождения, должны иметь соответствующее начальное отклонение вычитается из него, который является первым номером пары. Как только эта операция проводится набор новых пар чисел состоят из начального отклонения и соответствующая разница рассчитывается. Добавить 5 пар контроль 0,0 до этих 10 пар экспериментальных данных на якорь линейной регрессии при нулевой силе для нулевого отклонения. Это не абсолютно необходимо, но добавляет дополнительный степенью точности. Якорь на 0,0 основана на принципе, что игла не согнуты, когда сила не применялась. С помощью этих 15 пар данных расчета линейной регрессии. Изгиба пружины из стекла иглой калибруемой является провод иглы известно изгиба постоянной, деленной на наклон этой линии регрессии.
4. Калибровка обработки стекла иглы, используемые для работы нейронов
- Стекло иглы достаточного соответствия, 2-15 μdynes / мкм, которые будут использоваться в эксперименте на нейроны откалиброваны по промежуточным иглой стекло аналогичным образом, как описано в разделе 3. То есть, кандидат рабочих игл отвлечь промежуточных иглы известной жесткости помещается в положение проволоки иглу в разделе 3. Стекло иглы менее 2 μdynes / мкм может быть несколько сокращен до приведения их в соответствующий диапазон жесткости.
5. Иглы предварительно с приложением факторов
- Иглы должны рассматриваться вдавливаются в сторону комок глины состоялась в зажим установлен выше 10 мл стакан привязанности фактором решения, такие, что только кончик иглы погружают в раствор. Погружение капиллярной трубке вала нежелательно, так как он увеличивает накопление покрытие на кончике с течением времени, которое изменяет жесткость и снижает эффективность иглы привязанности. Калиброванные иглы могут быть использованы только примерно в 4 раза и может быть откалиброван для точности. Иглы погружают последовательно в 0,1% полилизином решение в течение 30 минут, а затем конканавалин (1 мг / мл в PBS) в течение 30 минут. Полилизином можно использовать многократно в течение нескольких недель и хранится при температуре -20 ° C. Сделать ConA свежие еженедельные и хранить при 4 ° C. Для других типов клеток, молекул представлены на их поверхности иглы может направлять ход расследования.
6. Комплект оборудования до
- Станция буксирных работ устанавливается на стол виброизоляции. Она состоит из инвертированного микроскопа оснащен бар по левому над сценой и гидравлическим манипулятором прилагаемый к ней, затаив уравновешенный настраиваемый модуль, в который двойной держатель инструмента будет вставлен. Позиция гидравлического микроманипулятора вдоль бара, поставив иглу в держатель на пути света микроскоп, в то время управления манипулятора сосредоточены в своих диапазонах. В то время, игла проходит лечение с приложением факторов, включите Ringcubator или другой столик микроскопа системы отопления, так что этап в тепловом равновесии в начале эксперимента.
7. Выравнивание иглы
- Цель состоит в том, чтобы получить две иглы (полномочий и иглы) в поле зрения микроскопа расположены так,их советы около 50 мкм друг от друга, друг от друга, со ссылкой выше культура блюдо, поэтому несколько не в фокусе, когда игла буксировке в фокусе на блюдо. Две иглы в их держателей иглы установлены в Leica двойной держатель инструмента, который сам по себе небольшой микроманипулятора. Использование микроманипуляция с двойной держатель инструмента, два совета вводятся в параллельном выравнивания. Вставить ссылку иглу в иглодержатель только короткое расстояние, достаточное, чтобы ужесточение воротник, чтобы захватить его и поместите эту сборку в правую сторону двойной держатель инструмента. Вставьте рассматриваться рабочей иглы половины ее длины в иглодержателя и поместить его в левую сторону двойной держатель инструмента. Когда два кончика иглы были доведены до той же переднее положение и построились, разной длины игл в их владельцев шатаются воротники, чтобы они не мешали получать советы очень близко друг к другу. Разделах 7.2 через 7,4 выполняются без увеличения. Разделы 7,5-7,8 какие делаются под микроскопом.
- Предустановленные гидравлического микроманипулятора так вертикального управления на всем пути вверх. Установите другие элементы управления, чтобы центр их диапазона, а также вперед / назад винт держателя инструмента.
- Принесите две иглы советы вместе с помощью из стороны в сторону регулировочный винт на правой стороне держатель инструмента. Затем нажмите иглодержатели себя вперед или назад в двойной держатель инструмента, как необходимые для доставки иглы советов же переднее положение. Изучите пару со стороны и использовать правую сторону вверх / вниз, винт принести советы в одной плоскости. Поворот иглодержатели в держатель инструмента, чтобы ликвидировать разрыв, если игла углы в иглодержатель.
- Свинг держатель инструмента и место советов в пути света над поверхностью СМИ, рыбалкой их вниз круто. Затяните винт шаровой шарнир в основании, прежде чем перемещать руку.
- Найти иголку советы в поле зрения микроскопа, прежде чем привести их слишком далеко вниз и сломать их и неправдами их с мусором на дне культуры блюдо. В 60 мм блюдо, 15 мл среды обеспечивает достаточную глубину запас прочности выше блюдо дно. Как начальная практика некалиброванных иглу, чтобы почувствовать этого шага. Начните с фокусировки вверх над клеток на дно тарелки с a10x цели. Сие творите в области блюдо от светочувствительных или штрафные экспериментальной клетки. Нижняя иглы в средствах массовой информации. Перемещение иглы стороны в сторону в поисках своей тени. Если вы не видите их, опустите их мало, и переместить их вперед в блюдо, повторите стороны в сторону перевала. Найти наконечник, перемещая назад (или вперед) и вниз.
- Включите из стороны в сторону винта, чтобы увидеть, какие иглы вы нашли. Если он движется с винтом вы смотрите на ссылку иглу, если она не это калиброванные иглы. Для калиброванные иглы, используйте стороны в сторону, винт нажать ссылку иглу к нему. Перемещение вперед и назад искал тень ссылкой на. Если это ссылка иглы вы нашли, винтовые его влево при перемещении гидравлического справа ищет калиброванные иглы.
- Когда обе иглы находятся использовать мелкий контроль двойной держатель инструмента для линии их. Крутой угол иглы ближайшие над краем блюдо причины вверх / вниз управление также вперед, удлиняя компонент для корректировки в сторону увеличения и сокращения пухом. Левую сторону, вперед / назад винт контроля противоположные, толкая вперед наконечник также вниз в блюдо, потянув ее назад отзывает иглы при одновременном повышении позиции наконечника. Таким образом, повышение полномочий и продвижении калиброванные иглы будет удлинить и сделать их еще на концах а также приведение их в оптимальное соотношение высоты над блюдом. Если ссылка игла выходит далеко за пределы рабочей иглы вы можете винт / PUSH рабочей иглы вниз и вперед, размахивая ссылкой вниз и сокращение его до двух еще и рабочая игла ниже. Иногда винты диапазон не принесет иглы вместе, так что вам может понадобиться аккуратно сдвиньте держатели сами, убедитесь, что шаровой шарнир винт хорошо затянуты и использовать ваши пальцы заклинило на край держателя инструмента применить силу, чтобы скользить валов. Вы можете также вращать иглодержатели в держатель инструмента как и прежде, в то время как в средствах массовой информации и наблюдения эффекта, видя, если они становятся ближе друг к другу.
- Запись изображения этого заключительного скорректированную позицию, отделение иглы без приложенной силы нулевого расстояния ссылки. Поднимите иглы над плоскостью образца и «парк» их на краю поля зрения.
- Загрязнение иглы могут быть удалены путем повышения его через мениска. Первый ход ссылкой иглы от других иглу, чтобы избежать две подсказки фиксации друг на друга. Несколько проходов может быть необходимым. </ OL>
- С этой точки, иглы были обнаружены непосредственно через микроскоп. Начиная с ячейки привязанности, наблюдения будут производиться как через микроскоп и на экран. Влево / вправо аспект обоих одинакова, но вверх / вниз ориентацию изображения на экран не совпадает с (гравитационного) вверх и вниз на микроскоп. Чтобы прояснить различия между вверх / вниз направлениях, как непосредственно наблюдать в микроскоп, и как наблюдать на видеоэкране, последняя будет называться "вверх" и "вниз", то есть в кавычках
- Процесс буксировки осуществляется путем изменения положения две иглы слева направо («горизонтальной») на экран. Следовательно, выбор экспериментального аксон производится частично на аксон расширения в том же «горизонтальный» направлении. Аксон может отклоняться "вниз" с "горизонтальной" на целых 15 °, так как это будет компенсироваться "толчок вверх" маневр разделе 8.5. Кроме того, аксон выбрали для манипуляции должна быть длина тела клетки, или больше, с активным конусом роста. Аксоны распространяется на право теле клетки являются предпочтительными из-за настройку двойной держатель инструмента с рабочей иглы установлен слева от ссылки иглы, так, что применяется напряжение во время буксировки расширяется разрыв между этими двумя иглами.
- Премьер аксона, которая простирается слева от тела клетки можно буксировать без переориентации двойной держатель инструмента созданного увеличению разрыва между иглами и повышения ссылкой иглы мало. Это позволяет буксировку иглы больше места, чтобы продемонстрировать на ссылку и перейти под его при необходимости. Буксировка будет затем перейти к левой и игла согнется буксировки к исходной иглу как напряжение возрастает. При анализе данных, это изменение в отношениях напряженности на ссылку расстояние вводится в таблицу путем вычитания измерения иглы разлуки с нулевого расстояния ссылке, а не нуля расстояние от места измерения.
- Перемещение иглы вблизи конуса роста аксонов, запись нулевого расстояния снова, поднимите иглы и воздуха до таблицу виброизоляции.
- Просто положить рабочей иглы перед опережающего роста конус может привести к спонтанным привязанности как опережает рост конуса. Чтобы проактивно управлять привязанность к росту конус, место буксировки иглу "ниже" конус роста и опустите иглу против блюдо дно. Это приведет к тому, чтобы отвлечь иглу "вверх", гибки и скольжения по блюду в рост конуса, выбить его и перемещения "вверх". Пресс иглу против блюдо дно как раз настолько, что рост конуса крючки вокруг кончика иглы, но не так далеко, что она скользит над иглой и слайдов назад. Подождите 20 минут, чтобы власть стала установлено. Набравшись опыта, успеха может достигать 90%, но в большей мере в 75% диапазона. На первый успех может быть ближе к 25%. Первичного ловушка, когда начала является "более манипулировать" роста конуса. Начальное взаимодействие в 'росту шаг "занимает несколько секунд. Рост конуса должны затем их оставили в покое, чтобы сформировать фирмы привязанности. Потом терпение должно осуществляться в течение следующих шагов.
- При росте конус на иглу, положить небольшое напряжение на нем путем перемещения иглы вправо, и поднять иглу немного. Компенсировать иглы движущихся "вниз", перемещая иглу немного вперед, поднимая. Поднимите поэтапно, пока вы не присоединенный процесс расширения перпендикуляр из иглы и над поверхностью блюдо. Перпендикулярной расположение аксонов простирается от иглы раз буксировки начался требуется для точных измерений силы, т. е. так, что единственным приложенной силы вектор вдоль оси аксона. Если буксируемых углы процесса от иглы, вектор силы рождается вдоль оси иглы, а не изгиба иглы и суммарная сила не измеряется. Получение от места начального вложения блюдо улучшает перспективы прочного привязанность к игле. Подсказка может быть выше поверхности посуды (если смотреть в небольших вибраций или иной плоскости фокуса от блюдо) или прикосновение к ней с минимальной силой. Слишком много перетащить на поверхность косого измерений. Иглы придерживаться блюдо, или сотовый процесс повторного присоединения к подложке приведет к загрузке силу, если вы продолжаете пытаться переместить его, который вдруг "появляется свободный» с возможной потерей вложений. Чтобы освободить иглу из таких камнем преткновения, перемещение иглы вперед и назад ("вверх" и "вниз" в плоскости экрана), а не добавлять больше сил (справа).
- Буксировка осуществляется с применением малых приращений силы путем перемещения иглы от тела клетки. Силы наблюденийВЭД как увеличивающийся разрыв между иглами. Хотя постепенно увеличивая напряжение, внимательно наблюдать за любыми признаками отряда роста конус с иглой.
- Если рост конус отделяется и не быстро втягивания, снижение напряженности и подождать немного, часто роста конус "догнать и захватить на кончике снова. Если аксон отрывается иглы поймать до того как он втягивается захватом его против блюдо с иглой и повторяя "толчок вверх" или "тянуть вниз", чтобы положить немного напряжение на нем и ждать около 10 минут для повторного вложения . После двух неудачных попыток, мы рекомендуем использовать другой ячейке.
- Поддержание уровня средств массовой информации в блюдо, добавив воды ежечасно в противовес испарение, используя отпечаток на стороне блюда, чтобы указать начальную глубину. С длинной пипетки Пастера, медленно добавляйте воду в сторону блюдо от иглы. Расширение процесса часто "киосков", если СМИ становится гиперосмотического. Испарение может быть уменьшена с маслом покрытия на поверхность средства массовой информации, но это должен быть добавлен после игла находится в средствах массовой информации. Если игла проходит через масло, рост конус гораздо менее вероятно, приложить к игле.
- В конце эксперимента, прежде чем поднять иглы из блюда, еще раз проверьте нулевого расстояния.
- Прочитано позиции иглы вдоль горизонтальной оси на экране, положение тела клетки и записи времен. Разделение расстоянии иглы минус выгружен нулевого расстояния умножаются на изгиб постоянной для иглы равно μdynes силы применяется. Калибровка изображения на экране расстояния, используя микрометр.
- Очень важно для качества данных является обеспечение ссылкой расстояние (нулевой силы) расстояние между иглами не меняется в процессе эксперимента. Тепловые изменения коснутся оборудования по шкале микрона, то есть не включайте кондиционер во время эксперимента. Кроме того, если ваш микроскоп система отопления имеет временной лаг ждать, пока у вас есть термической стабильностью. Ringcubator уменьшается временной лаг, а также изолирует тепловых изменений в блюдо от остальной части микроскопа и манипуляций системой уменьшения теплового дрейфа нуля и изменений в фокусе. Другой силу изменения выгружен разделения иглы является поверхностное натяжение на иглу валов. Изменения нагрузки с глубиной жидкости в блюде. Проверка ссылки расстояния за счет резервного копирования иглы и временно видя никакой силы нулевого расстояния иногда во время эксперимента улучшает качество данных, даже если вы отмечают изменение разделения.
8. Прикрепление к клеткам
9. Расширение аксонов или клеточных процессов
10. Анализ данных
11. Представитель Результаты:
Форс-калиброванные стеклянные иглы могут быть легко применены к любой сотовой регионе, как правило, рост конуса, как визуализировать непосредственно с помощью световой микроскопии. При соответствующем лечении иглы для получения сотовой привязанности, механического напряжения могут быть экспериментально применяться к сотовой области интересов или сил, создаваемых этом регионе могут быть измерены. Представитель нейронов эксперимент буксировки показан на рисунке 1, где буксируемого аксон был удвоен длиной в два часа.
Рисунок 1. Культурный куриные задний корешок ганглиозных клеток с преимущественной ориентацией для буксировки выбран. Нулевого начального расстояния между ссылкой иглы фиксируется до экспериментальные манипуляции начинает (А). "Толчок вверх" маневр применяется для роста конуса (B). Буксировка начинается с увеличенной загрузкой силу, как указано разделение иглы (С). Буксировка расширила аксона, "горизонтальные" и перпендикулярно выравнивания буксируемых аксонов и рабочей иглы способствовали хорошие измерения силы (D). Бар = 40 мкм. Иглы калибровки = 6,9 μdyne / мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы применения и меру сотовой силы имеют давнюю историю 9. Наш метод первоначально был мотивирован работой Деннис Брей, которые использовали стеклянные иглы похожи на наши, чтобы "буксире" нейронов при постоянной скорости использованием моторизованных гидравлические устройства 10. Есть много альтернативных средств применения силы клеток, которые включают в себя: шаговых двигателей 11, магнитных шариков 12, microfabricated пучка 13 и потоков жидкости 14. Последние похож на нашего подхода в том, что сотовые зонд, в конечном счете откалиброваны изгиба луча известна жесткость и сотовой измерений зависит от оптических микроскопических наблюдений. По сравнению с другими подходами, основное преимущество нашего метода 3 является возможность одновременно применять и измерять силы в μdyne диапазон, используя оборудование (микроскопы и микроманипуляторами), характерных для отделов науки о жизни.
Используя эти методы, силы, с которыми нейронов конусы роста, поскольку они заранее были измерены 15. Механические отношения аксонального скорости удлинения в ответ на напряжение было определено следовать ньютоновской жидкостью, как стимул-реакция 7. Относительная чувствительность аксонов в ответ на напряжение было показано, что больше для центральных нейронов мозга, чем для периферийных нейронов куриного эмбриона 2. Втягивание аксонов была также исследована 7. Нейроны, не определяется аксонов могут иметь свои аксонального / дендритных полярности контролируется применением механического напряжения 5. В фибробласты выражения GFP-меченых актина или тубулина, мы непосредственно визуализировать реакцию цитоскелета простым крепления игл, а также его ответ на изменения напряжения 8. Сотовые вложения друг к другу или субстратов были протестированы 1. Пропульсивной силы подвижных клеток могут быть рассмотрены и тяните приближающихся filipodia могут быть измерены 16. Движения отображается меченых митохондрий в буксируемых аксонов были использованы для моделирования внутреннего транспорта материала (низкая скорость переноса) и определить, что нейроны расти на интеркалированных Помимо массы по длине аксонов вала 6,17.
Для следователи просто заинтересованы в применении силы без их измерения, использование ссылки игла не требуется 18. Напротив, если сила измерения желаемого ссылкой игла имеет важное значение для получения точных данных. В целом, мы оцениваем ошибки в абсолютных измерений силы, чтобы быть в диапазоне от 5% до 10% с наибольшим источником ошибок, возникающих в процессе чтения данных. Сложность состоит в точности определения местоположения расфокусированным ссылкой иглы и сведение к минимуму воздействия малых и обратно движений (колебаний) иглы. Без ссылки иглы, эти источники ошибок будет еще больше.
Экспериментальные манипуляции не заканчиваются буксировки сессии. Буксируемые конусы роста могут быть присоединены к другим клеткам или подключить к блюду 5. Используя эту возможность манипулятивной, нейронные микро-circutry может намеренно быть настроен, что позволяет перекрестные помехи различных типов клеток, подлежащих рассмотрению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы выражаем искреннюю благодарность важный вклад д-ра Роберта Э. Буксбаум в развитии этой методологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
