Summary
Mediciones y la aplicación directa de las fuerzas sobre las neuronas en el rango de Microdyne 2000-1000 se logran con alta precisión utilizando agujas de vidrio calibrado. Esta metodología se puede utilizar para controlar y medir varios aspectos del desarrollo axonal, incluyendo la iniciación axonal, la tensión axonal, la velocidad de elongación axonal, y vectores de fuerza.
Abstract
Manipulación de células y la extensión de los axones neuronales se puede lograr con vidrio calibrado micro fibras capaces de medir y la aplicación de fuerzas en el rango de 1,2 10-1000 μdyne. Las medidas de fuerza se obtienen mediante la observación de la Hookean flexión de las agujas de cristal, que son calibrados por un método directo y empírico 3. Necesidades de equipo y procedimientos para la fabricación, la calibración, el tratamiento y el uso de las agujas de las células se describen con detalle. La fuerza de los regímenes anteriores, los diferentes tipos de células a las que estas técnicas se han aplicado pruebas de la flexibilidad de la metodología y se dan como ejemplos para la investigación futura 4.6. Las ventajas técnicas son las continuas 'visualización' de las fuerzas producidas por la manipulación y la capacidad de intervenir directamente en una variedad de procesos celulares. Estos incluyen la estimulación directa y regulación del crecimiento axonal y la retracción del 7, así como el desprendimiento y mediciones mecánicas en cualquier tipo de cultivo celular 8.
Protocol
1. Que las agujas de cristal.
- Un ajuste de micro-aguja extractor se utiliza para la fabricación de agujas con punta cónica de 4 mm de longitud y que se cierran las vigas sólidas. A diferencia de una punta larga y flexible, este corto 4 mm de largo los límites de las vibraciones de la punta de la aguja durante los experimentos. En la región proximal de la fibra de 4 mm, la aguja se estrecha rápidamente a partir del diámetro del tubo de vidrio a 15 micras dentro de 1 mm, mientras que la más distal de 1 mm de la fibra es de 2,5 micras de diámetro. Usamos R-6 tubo de vidrio capilar, 0,9 mm OD, ID 0.6 mm de longitud 8 "y un extractor de BB-CH. Si el investigador está interesado en otros rangos de medición vigente, agujas con propiedades diferentes de primavera (es decir, de una longitud diferente y ni ) de espesor se debe tirar. Cada tubo capilar se detiene en cuatro 2 "agujas. Las agujas se almacenan en cubierta 160 mm placas de Petri con "serpientes" dos plastilina en la que las agujas se presiona ligeramente.
- Las agujas de vidrio, así como de una aguja metálica que se describen, son esencialmente las vigas utilizadas como fuentes de flexión de la rigidez adecuada para las mediciones de la fuerza deseada. Tenga en cuenta que la fuerza de flexión de una viga de escalas como el cubo de su longitud, independientemente de la composición. Así, por cualquiera de los pasos de calibración se describe a continuación, un haz de agujas / de la rigidez suficiente se pueden hacer más rígida por una pequeña cantidad de manteca (por ejemplo, una reducción del 10% produce un aumento del 28% de la rigidez, es decir, 0,9 3).
2. Decisiones y la calibración de una aguja metálica
- Hacer una aguja de calibración mediante la inserción de un alambre de .001 "alambre Chromel por el interior de una aguja de vidrio (hecho en la sección 1.1) con la punta rota. Jale el cable de la punta de una longitud de 26 mm y pegarlo en su lugar con pegamento. Dobla la parte distal de 1 mm del alambre en forma de gancho.
- Realizar micro-pesas de 1 metro de 0,003 "hilo Constantan. Para medir el alambre, cinta a un metro para ayudarle a obtener lo más recto posible. Pesar de 1 m de cable, con precisión para cortar trozos de 1 cm, y doble varias piezas en Vs
- Calibración de las agujas de alambre requiere un microscopio de disección con una retícula de medición y un micromanipulador. El microscopio está inclinado 90 ° en su lado con un codo universal, de tal manera que una desviación a la baja de la aguja de alambre se puede observar. Monte la aguja metálica de la sección 2.1 en un soporte de herramientas en un micromanipulador de tal manera que la región enganchado es perpendicular al eje óptico del microscopio. Alinear el gancho de la aguja de alambre con un signo de punto de mira. Cuelgue el micro de 1 cm de peso en el gancho y el registro de la desviación. La constante de flexión (μdynes / m) del cable de referencia se calcula como el cociente entre el peso de micro-(nota: 1 mg = 0,98 dinas) dividido por la desviación observada (m). Para preparar la aguja metálica para el siguiente paso, cortar el gancho en el punto de pesaje con un bisturí. La presencia del gancho es el peso adicional que se dobla el alambre en un pequeño grado. Por lo tanto, los efectos de la posición inicial del cable en el punto de mira antes de que el peso se añade. La medición de la constante de resorte de metal se deriva de la desviación del alambre cuando el peso se añade al punto de doblar (punta de futuro de la red). Cuando el gancho se corta no cambia la constante del resorte del cable.
3. Calibración de las agujas de vidrio intermedia
- Calibración de las agujas de vidrio intermedia requiere el uso de un microscopio invertido con una retícula ocular. A un lado de la platina del microscopio es un micromanipulador mecánico que se utiliza para mantener la aguja metálica de la sección 2 en el centro del campo óptico. En el otro lado es un micromanipulador tres ejes hidráulicos (véase la tabla de equipos) para mover la aguja de vidrio intermedia que se está calibrando. Utilizando el micromanipulador, llevar las dos agujas juntas en el centro del campo óptico en un ángulo de aproximadamente 45 a un 160 mm x 30 mm placa de Petri de agua en un campo de 10 aumentos.
- Una serie de agujas tiró con diferentes configuraciones en el extractor de la pipeta se generó por primera vez para su evaluación. El objetivo es hacer una aguja de vidrio intermedia con un resorte de flexión constante de 20-30 μdynes / m. Determinación de la rigidez se hace midiendo la proporción de la desviación de la aguja intermedia en comparación con la desviación de la aguja de alambre. Por ejemplo, con las agujas de alambre y vidrio de tocar, la aguja de vidrio se mueve para desviar la aguja de alambre a una distancia de 5 puntos en el punto de mira como se ve a través de los oculares. Mover la aguja de vidrio lateral desactiva las agujas. La aguja de alambre luego vuelve a su posición inicial, pero la aguja de vidrio estará ahora en una nueva posición. La carga de la aguja de vidrio se calcula a partir de su nueva posición de fuerza cero, menos la posición de las agujas en la misma fuerza de carga (dos agujas comprometido). En este ejemplo, si las dos agujas son desviados para marcar 5 (a partir de cero en el punto de mira), la aguja de alambre volverá a cero, mientras que el GLAss aguja podría primavera a 25, si es así, se inclinó 20 puntos con la misma fuerza que la flexión del alambre de la aguja 5 puntos. Por lo tanto, la relación de flexión entre las dos agujas da la calibración de la aguja de vidrio y es ¼ tan rígida como la aguja de alambre. Debido a que los cálculos de la constante del resorte en la sección 3.4 usar las razones de las distancias que son independientes de la ampliación o el tamaño de la división de retícula. La única consideración que la limitación es que las desviaciones son suficientemente pequeñas como para estar en el rango elástico lineal de las agujas.
- Hacer una serie de desviaciones en las posiciones de 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 marcas en el punto de mira. Si cualquier desviación de liberación antes de tiempo repetir esos. Entre las desviaciones que la aguja de alambre alineada en cero. Para cada una de estas desviaciones, tenga en cuenta la cantidad desviada y la final de cero carga de la posición de la aguja de vidrio después de la liberación. Esto crea 10 pares de puntos de datos. Otras secuencias se puede utilizar, pero esta serie fue diseñada para dar los primeros indicios de la consistencia interna, la linealidad y la histéresis (resultados de las deflexiones 5 + 10 = 15; 3 +7 = 10; el 5,10,15 deformaciones después de la liberación debe ser de aproximadamente la misma al principio y al final).
- Regresión lineal de las desviaciones registradas en la sección 3.3 ofrece una cuantificación más precisa de la constante inclinación de la aguja de vidrio intermedio de una relación de simple deflexión. También proporciona una evaluación de la linealidad de la aguja y la calidad de la calibración indicado por un valor r mayor y la cercanía de la intersección de la línea de regresión a cero. Para preparar los 10 pares de datos de la sección 3.3 de la regresión, el segundo número de las parejas registradas, la final de cero carga de la posición de la aguja de vidrio después de la liberación, debe tener la desviación inicial correspondiente resta de él, que es el primer número de el par. Una vez que esta operación se lleva a cabo el conjunto de pares de números nuevos consisten en la deformación inicial y la diferencia correspondiente. Añadir 5 pares de control de 0,0 a estos 10 pares de datos experimentales para anclar la regresión lineal a cero la fuerza de deflexión cero. Esto no es absolutamente necesario, pero añade un grado extra de precisión. Anclaje en 0,0 se basa en el principio de que la aguja no se dobla cuando la fuerza no se aplica. Con estos 15 pares de datos calcular una regresión lineal. El muelle de flexión constante de la aguja de vidrio que se está calibrando es la aguja de alambre que se conoce flexión constante dividida por la pendiente de esta recta de regresión.
4. Calibración de la aguja de vidrio de trabajo utilizado para manipular las neuronas
- Agujas de vidrio de cumplimiento suficiente, 2-15 μdynes / m, para ser utilizado de forma experimental en las neuronas son calibrados con la aguja de vidrio intermedio de una manera análoga a la descrita en la sección 3. Es decir, agujas candidato de trabajo desviar una aguja intermedio de la rigidez se conoce en la posición de la aguja de alambre en la sección 3. Agujas de vidrio de menos de 2 μdynes / m pueden ser ligeramente recortados para ponerlas en el rango de la rigidez adecuada.
5. Las agujas son tratados previamente con los factores de unión
- Agujas a tratar se presiona en el lado de un trozo de arcilla a cabo en una pinza de conjunto por encima de un vaso de precipitados de 10 ml de la solución de fijación de los factores, de tal manera que sólo la punta de la aguja se encuentra inmerso en la solución. La inmersión del eje del tubo capilar no es deseable, ya que aumenta la acumulación de recubrimiento en la punta con el tiempo, que cambia la rigidez y disminuye la eficacia de la aguja del apego. Una aguja calibrada sólo se puede utilizar aproximadamente 4 veces y se puede calibrar para mayor precisión. Las agujas se sumergen secuencialmente en solución al 0,1% de polilisina durante 30 minutos y luego concanavalina A (1 mg / ml en PBS) durante 30 minutos. La polilisina pueden utilizar varias veces durante varias semanas y se almacenan a -20 ° C. Haga semanal ConA fresco y se almacenan a 4 ° C. Para otros tipos de células presentan las moléculas en su superficie por la aguja puede dirigir el curso de la investigación.
6. Equipo establecido
- La estación de trabajo de remolque se instala en una mesa de aislamiento de vibraciones. Se compone de un microscopio invertido equipado con un bar junto a la izquierda por encima del escenario y un manipulador hidráulico unido a él, la celebración de nuestra extensión personalizada con contrapeso, en el que el portaherramientas doble se inserta. La posición del micromanipulador hidráulico a lo largo de la barra, al colocar una aguja en su soporte en la trayectoria de la luz del microscopio, mientras que los controles del manipulador se centran en sus rangos. En el momento está siendo tratado con la aguja de los factores de unión, a su vez en el Ringcubator u otro sistema de calefacción platina del microscopio, por lo que el escenario está en equilibrio térmico en el comienzo de los experimentos.
7. La alineación de las agujas
- El objetivo es conseguir que las dos agujas (la referencia y la aguja de trabajo) en el campo visual del microscopio dispuestos de manerasus consejos son alrededor de 50 m de distancia, además, con la referencia por encima de la placa de cultivo, por lo tanto, un poco fuera de foco cuando la aguja de arrastre está en centrarse en el plato. Las dos agujas en los titulares de sus agujas se montan en un Leica doble herramienta de soporte, que es en sí un micromanipulador pequeños. Uso de la micromanipulación del titular de dos herramientas, las dos puntas se ponen en alineación paralela. Insertar la aguja de referencia en un porta-agujas a una corta distancia, lo suficiente como para permitir que el collar de ajuste para que el agarre y el lugar esta asamblea en el lado derecho del titular de la herramienta de doble. Inserte la aguja de trabajo tratan la mitad de su longitud en el soporte de la aguja y colóquela en el lado izquierdo del portaherramientas doble. Cuando las dos puntas de la aguja se señalan a la misma posición anterior y se alinearon, las diferentes longitudes de las agujas en sus titulares de escalonar el cuello para que no supongan un obstáculo para conseguir las puntas muy próximas entre sí. Secciones 7.2 a 7.4 se hacen sin aumento. Secciones 7.5-7.8 se realizan bajo la observación microscópica.
- Pre-establecido el micromanipulador hidráulico para el control vertical es el camino. Establecer los otros controles en el centro de su rango, y también el avance / retroceso tornillo del soporte de la herramienta.
- Llevar las dos puntas de las agujas junto con el tornillo de ajuste de lado a lado en el lado derecho del titular de la herramienta. A continuación, pulse el porta-agujas se adelante o hacia atrás en el portaherramientas doble, según sea necesario para que las puntas de la aguja a la posición delantera mismo. Examinar a la pareja de al lado y usar el lado derecho hacia arriba / abajo del tornillo para que las puntas en el mismo plano. Gire los titulares de la aguja en el porta-herramientas para cerrar la brecha si los ángulos de la aguja en su porta-agujas.
- Gire el soporte de herramientas y coloque las puntas en la trayectoria de la luz sobre la superficie de los medios de comunicación, pesca con caña hacia abajo en picado. Apriete el tornillo de la rótula en la base antes de mover la mano.
- Encontrar puntas de aguja en el campo visual del microscopio antes de llevarlos demasiado lejos y los rompen o por las malas con escombros en la parte inferior de la placa de cultivo. En un plato de 60 mm, 15 ml de medio proporciona la suficiente profundidad para un margen de seguridad por encima de la parte inferior plato. ¿Es una práctica inicial con una aguja calibrada para conseguir la sensación de este paso. Empezar por centrarse hacia arriba por encima de las células en el fondo del plato con el objetivo de A10X. Haced esto en un área de la antena de la luz células sensibles experimental o ejemplares. Baje las agujas en los medios de comunicación. Mover el lado agujas a lado en busca de su sombra. Si usted no los ve, los bajos un poco y se mueven hacia adelante en el plato, repetir la parte que pase lateral. Encontrar la punta, moviendo hacia atrás (o hacia delante) y hacia abajo.
- Gire el tornillo de lado a lado para ver que la aguja se han encontrado. Si se mueve con el tornillo que está buscando en la aguja de referencia, si no es la aguja calibrada. Para calibrar la aguja, usar el lado de tornillo lateral para empujar la aguja de referencia hacia ella. Se mueven hacia adelante y atrás en busca de la sombra de la referencia. Si se trata de la aguja de referencia que hemos encontrado, que el tornillo a la izquierda mientras se mueve el sistema hidráulico a la derecha en busca de la aguja calibrada.
- Cuando las dos agujas se encuentran bien utilizar los controles del portaherramientas doble para alinearlos. El ángulo agudo de las agujas que viene sobre el borde del plato hace que el arriba / abajo de control para tener también un interés, el alargamiento de componentes para el ajuste al alza y la manteca con una hacia abajo. La parte izquierda, adelante / atrás el control de tornillo tiene todo lo contrario, empujándolo con la punta hacia abajo también en el plato, tirándolo hacia atrás retira la aguja, mientras que elevar la posición de la punta. Por lo tanto, elevar la referencia y el impulso de la aguja calibrada se alargará tanto para hacer que incluso en los extremos al mismo tiempo que los pone en la relación óptima de la altura por encima del plato. Si la aguja de referencia se extiende mucho más allá de la aguja de trabajo se puede atornillar / empujar la aguja de trabajo hacia abajo y adelante mientras gira la referencia de abajo y la manteca hasta que los dos son pareja y la aguja de trabajo es el más bajo. A veces el rango de los tornillos no traerá las agujas juntos, lo que puede tener para deslizar suavemente los titulares de sí mismos, asegúrese de que el tornillo de la rótula esté bien apretado y el uso de sus dedos metido en el borde del soporte de herramientas para aplicar la fuerza para desplazar la ejes. Usted también puede rotar el porta-agujas en el soporte de la herramienta como antes, mientras que en los medios de comunicación y la observación de la realidad, ver si se están acercando entre sí.
- Grabar la imagen de esta posición ajustado final, la separación de las agujas sin ningún tipo de fuerza aplicada es la distancia de referencia cero. Aumentar las agujas por encima del plano de muestras y "parque" que en el borde del campo visual.
- Escombros en una aguja puede ser eliminado mediante el aumento a través de los meniscos. Primero mueve la aguja de referencia de la aguja para evitar que otros las dos puntas de enganche a la otra. Múltiples pasos pueden ser necesarios. </ Ol>
- En este punto, las agujas se han observado directamente a través del microscopio. A partir de la adhesión celular, las observaciones se realizarán tanto a través del microscopio y en la pantalla de vídeo. El aspecto de la izquierda / derecha de ambas es idéntico, pero la orientación hacia arriba / abajo de la imagen en la pantalla de vídeo no es la misma (la gravedad) arriba y abajo en el microscopio. Para aclarar las diferencias entre las direcciones arriba / abajo como se observa directamente a través del microscopio y como se observa en la pantalla de vídeo, este último se conoce como 'arriba' y 'abajo', es decir entre comillas
- El proceso de remolque se realiza mediante la alteración de la posición de las dos agujas de izquierda a derecha ("horizontal") en la pantalla de vídeo. En consecuencia, la elección del axón experimental se realiza en parte en el axón se extiende en la misma "horizontal" de la dirección. El axón puede desviarse "hacia abajo" de la "horizontal" por tanto como 15 °, ya que esto será compensado por la maniobra de "push up" de la sección 8.5. Además, el axón elegido para la manipulación debe ser la longitud de un cuerpo celular, o más, con un cono de crecimiento activo. Axones se extienden a la derecha del cuerpo de la célula se prefieren debido a la puesta en marcha del portaherramientas doble con la aguja de trabajo montada a la izquierda de la aguja de referencia, de tal manera que la tensión aplicada durante el remolque se ensancha la brecha entre las dos agujas.
- Un axón principal que se extiende a la izquierda del cuerpo celular puede ser remolcado sin una reorientación del titular de doble herramienta creada por la ampliación de la brecha entre las agujas y el aumento de la aguja de referencia un poco. Esto permite que el espacio de la aguja de arrastre más flexible hacia la referencia y pasar por debajo de él si es necesario. El remolque pasarán a la izquierda y la aguja se doble remolque hacia la aguja de referencia a medida que aumenta la tensión. Al analizar los datos de este cambio en la relación de tensión a la distancia de referencia se introduce en la hoja de cálculo restando la medida de separación de la aguja de la distancia de referencia cero en lugar de la distancia cero de la medición.
- Mover las agujas cerca del cono de crecimiento del axón, registrar la distancia cero otra vez, aumentar las agujas, y el aire hasta la mesa de aislamiento de vibración.
- Basta con poner la aguja de trabajo frente a un cono de crecimiento puede producir el avance apego espontáneo a medida que avanza el crecimiento del cono. De manera proactiva manipular un archivo adjunto al cono de crecimiento, colocar la aguja de arrastre hacia abajo "por debajo" del cono de crecimiento y baja la aguja contra la parte inferior plato. Esto hará que la aguja para desviar "hacia arriba", flexión y deslizamiento a lo largo del plato en el cono de crecimiento, desalojando y moviéndola "hacia arriba". Presione la aguja contra la parte inferior plato lo suficiente para que el cono de crecimiento alrededor de los ganchos de la punta de la aguja, pero no tan lejos que se desliza sobre la aguja y se desliza hacia atrás. Espere 20 minutos para permitir un agarre se establezcan. Con la experiencia, la tasa de éxito puede ser tan alta como 90%, pero es más típicamente en el rango de 75%. Al principio, la tasa de éxito puede estar más cerca de un 25%. La dificultad principal al principio es "más de manipular" el cono de crecimiento. La interacción inicial en el "empuje a paso 'toma unos segundos. El cono de crecimiento se debe dejar sola para formar una unión firme. A continuación, la paciencia debe ser ejercido durante los siguientes pasos.
- Cuando el cono de crecimiento está en la aguja, coloque una ligera tensión en él, moviendo las agujas a la derecha y subir la aguja un poco. Compensar la aguja que se mueve "hacia abajo", moviendo la aguja hacia adelante un poco mientras criaba. Aumentar en las etapas hasta que el proceso asociado se extiende perpendicular de la aguja y por encima de la superficie del plato. La disposición perpendicular de los axones que se extienden desde las agujas de arrastre, una vez ha comenzado, es necesario para las medidas de fuerza precisa, es decir, por lo que el único vector de fuerza aplicada a lo largo del eje del axón. Si los ángulos proceso de arrastre de la aguja, un vector de la fuerza que nace en el eje de la aguja en lugar de doblar la aguja y el total de la fuerza no se mide. Alejarse del lugar de la fijación inicial plato mejora las perspectivas de una unión duradera a la aguja. La punta puede estar por encima de la superficie del plato (se ve en las vibraciones poco o un plano diferente del enfoque de la antena) o tocar con una fuerza mínima. El exceso de fricción en la superficie se sesgar las mediciones. Una aguja se pegue al plato, o el proceso de volver a conectar la célula al sustrato dará lugar a fuerza de carga si sigues tratando de moverlo, que de repente "aparece suelta 'con la posible pérdida de los datos adjuntos. Para liberar la aguja de un punto de fricción, mover la aguja hacia adelante y hacia atrás ("arriba" y "abajo" en el plano de la pantalla) en lugar de añadir más fuerza (derecha).
- Remolque se lleva a cabo mediante la aplicación de pequeños incrementos de la fuerza por movimiento de las agujas del cuerpo celular. Las fuerzas se observed como una creciente brecha entre las agujas. Aunque poco a poco aumentando la tensión, observe cuidadosamente si hay signos de desprendimiento del cono de crecimiento de la aguja.
- Si el cono de crecimiento y no se separa rápidamente de retracción, disminuir la tensión un poco y esperar, a menudo el cono de crecimiento "ponerse al día" y agarrar la punta de nuevo. Si el axón sale de la aguja de atraparlo antes de que se retrae por la captura contra el plato con la aguja y repetir el 'push up' o 'bajar' a poner un poco de tensión en ella y esperar unos 10 minutos para la re-unión . Después de dos intentos fallidos, se recomienda utilizar una celda diferente.
- Mantener el nivel de los medios de comunicación en el plato con la adición de agua por hora a la evaporación de contrapeso, con una marca en el lado del plato para indicar la profundidad inicial. Con una larga pipeta Pasteur, agregue lentamente el agua en el lado de la antena lejos de las agujas. Extensión de un proceso a menudo "puestos" si los medios de comunicación se convierte en hiperosmótico. La evaporación puede ser disminuido con una capa de gas en la superficie del medio, pero esto habría que añadir después de la aguja está en los medios de comunicación. Si la aguja pasa a través del petróleo, el cono de crecimiento es mucho menos probable que se adhieren a la aguja.
- Al final del experimento, antes de levantar las agujas del plato, otra vez, la distancia cero.
- Lea las posiciones de las agujas a lo largo de un eje horizontal en la pantalla, la posición del cuerpo celular y registrar los tiempos. La distancia de separación de las agujas menos la distancia de descarga cero multiplicado por la constante flexión de la aguja es igual a la μdynes de la fuerza que se aplica. Calibrar las distancias imagen de la pantalla utilizando un micrómetro.
- Muy importante para asegurar la calidad de los datos es la distancia de referencia (cero fuerza) la separación entre las agujas no cambia durante el experimento. Cambios térmicos que afectan a los equipos en la escala del micrón, es decir, no encienda el aire acondicionado durante un experimento. Además, si su sistema de calefacción microscopio tiene un lapso de tiempo esperar hasta que haya estabilidad térmica. El Ringcubator disminuye el tiempo de espera y también aísla los cambios térmicos en el plato del resto del microscopio y el sistema de manipulación de la disminución de la deriva térmica del cero y los cambios en el enfoque. Otra fuerza de alterar la separación descargadas de la aguja es la tensión superficial en los ejes de la aguja. La carga de los cambios con la profundidad del líquido en el plato. Comprobación de la distancia de referencia de copias de seguridad de las agujas y ver la distancia temporal no-force cero de vez en cuando durante un experimento de mejora de la calidad de los datos, incluso si usted está observando un cambio en la separación.
8. Una a las células
9. Ampliación de un proceso de axón o celular
10. Análisis de Datos
11. Los resultados representativos:
La fuerza de calibrado agujas de vidrio se puede aplicar fácilmente a cualquier región celular, por lo general el cono de crecimiento, tal como se visualiza directamente por microscopía de luz. Con el tratamiento apropiado de la aguja para obtener adhesión celular, la tensión mecánica puede ser experimentalmente aplicadas en la región celular de interés, o las fuerzas producidas por la región se puede medir. Un experimento representativo neuronal de remolque se muestra en la Figura 1, donde se ha duplicado el axón remolcado de longitud en dos horas.
Figura 1. A raíz dorsal cultivadas de pollo de las células ganglionares de la orientación preferida para el remolque que se elija. La distancia inicial de referencia cero entre las agujas se registra antes de la manipulación experimental se inicia (A). El 'push up' maniobra se aplica al cono de crecimiento (B). Remolque comienza con la carga de fuerza mayor según lo indicado por la separación de las agujas (C). Remolque se ha extendido el axón, las alineaciones "horizontal" y perpendicular del axón y la aguja de arrastre de trabajo han facilitado buenas medidas de fuerza (D). Bar = 40 micras. Calibración de la aguja = 6,9 μdyne / m.
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Discussion
Técnicas a aplicar y medir fuerzas celulares tienen una larga historia 9. Nuestro método fue motivada inicialmente por el trabajo de Dennis Bray, que utiliza agujas de vidrio similar a la nuestra a 'remolque' las neuronas a un ritmo constante, utilizando un dispositivo motorizado hidráulico 10. Hay muchos medios alternativos de la aplicación de fuerzas a las células que son: motores paso a paso 11, 12 bolas magnéticas, rayos microfabricated 13 y los flujos de fluidos 14. Estos últimos son similares a nuestro enfoque en el que la sonda celular es en última instancia, calibrado con una viga de flexión de la rigidez de las medidas conocidas y celulares dependen de las observaciones microscópicas ópticas. En comparación con otros enfoques, la principal ventaja de nuestro método 3 es la capacidad de aplicar de forma simultánea y medir fuerzas en el rango de μdyne con equipos (microscopios y micromanipuladores) típica de los departamentos de ciencias de la vida.
El uso de estos métodos, las fuerzas ejercidas por los conos de crecimiento neuronal a medida que avanzan se han medido 15. La relación mecánica de la tasa de elongación axonal en respuesta a la tensión se ha decidido a seguir un telescopio newtoniano de fluido como estímulo-respuesta 7. La sensibilidad relativa de los axones en respuesta a la tensión se demostró que era mayor para las neuronas del cerebro central que para las neuronas periféricas del embrión de pollo 2. La retracción de los axones también se ha investigado 7. Neuronas con axones no determinado puede tener su polaridad axonal / dendríticas controlado por la aplicación de la tensión mecánica 5. En los fibroblastos que expresan GFP-etiquetados actina o la tubulina, que visualiza directamente la respuesta del citoesqueleto a la conexión simple de la aguja, así como su respuesta a los cambios de tensión 8. Archivos adjuntos de células entre sí o sustratos han sido probados 1. Las fuerzas de propulsión de células móviles podrían ser examinados y el tirón de acercarse a filipodia se podría medir 16. Los movimientos mostrados por las mitocondrias etiquetados dentro de los axones de arrastre se han utilizado para el transporte de material modelo interno (transporte de baja velocidad) y determinar que las neuronas crecen por adición de masa intercaladas a lo largo del eje axonal 6,17.
Para los investigadores simplemente interesados en la aplicación de fuerzas sin medirlos, el uso de la aguja de referencia no se requiere de 18 años. Por el contrario, si las medidas de fuerza se desea que la aguja de referencia es esencial para generar datos precisos. En general, estimamos que el error en las mediciones de la fuerza absoluta de estar en el rango de 5% a 10% con la mayor fuente de error que surgen en el proceso de lectura de datos. La dificultad radica en identificar con precisión la ubicación de la aguja de referencia desenfocado y minimizar los efectos de la espalda de pequeños movimientos adelante y hacia atrás (vibraciones) de las agujas. Sin aguja de referencia, estas fuentes de error sería aún mayor.
Manipulaciones experimentales no tiene por qué acabar con la sesión de remolque. Conos remolcado el crecimiento se puede conectar a otras células o volver a conectar el plato 5. Aprovechando esta oportunidad de manipulación, neuronal micro-circutry intencionalmente puede ser configurado, lo que permite interferencias de diferentes tipos de células para ser examinados.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos las importantes contribuciones del Dr. Robert E. Buxbaum en el desarrollo de esta metodología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
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- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
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